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英文名稱(chēng)：N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg efect: implication in colorectal cancer
中文名稱(chēng)：N6-甲基腺苷（m6A）閱讀蛋白IMP2能穩定ZFAS1/OLA1軸并激活沃伯格效應：在結直腸癌中的意義
雜志名稱(chēng)：J Hematol Oncol.
影響因子：17.233
摘要
背景：越來(lái)越多的證據表明N6-甲基腺嘌呤（m6A）調節因子有助于結直腸癌（CRC）的病因學(xué)和進(jìn)展研究。然而，參與糖酵解代謝的m6A閱讀蛋白的確切機制仍然模糊不清。本文旨在將m6A閱讀蛋白與糖代謝串聯(lián)起來(lái)，揭示一種CRC進(jìn)展的新機制。
方法：通過(guò)生物信息學(xué)、ISH和IHC檢測，分析了候選lncRNA和m6A閱讀蛋白之間的關(guān)系。利用體內和體外研究（包括MTT、CFA、反式孔、細胞凋亡、免疫印跡、qRT-PCR和異種移植小鼠模型）來(lái)探討這些指標的生物學(xué)功能。利用乳酸檢測、ATP活性檢測和ECAR檢測驗證其下游靶點(diǎn)的生物學(xué)功能。利用生物信息學(xué)、RNA穩定性、RIP實(shí)驗和RNA下拉實(shí)驗探索其潛在的分子機制。
結果：本文發(fā)現在CRC增殖和進(jìn)展過(guò)程中，m6A閱讀蛋白IMP2與長(cháng)鏈非編碼RNA（lncRNA）ZFAS1以依賴(lài)m6A調節的方式進(jìn)行串聯(lián)，隨后增強了OBG-樣ATPsae1（OLA1）和腺嘌呤三磷酸（ATP）水解和糖酵解的募集。
材料方法
實(shí)驗樣本：144對CRC組織和對應的癌旁組織；CRC細胞系和正常人腸道上皮細胞系
實(shí)驗方法：lncRNA-mRNA芯片測序，qPCR，WB蛋白印跡分析，組織微陣列（TMA）和免疫組化（IHC），lncRNA ISH檢測，細胞增殖實(shí)驗，細胞克隆實(shí)驗（CFA），細胞凋亡檢測，細胞遷移實(shí)驗，免疫熒光實(shí)驗（IF），m6A斑點(diǎn)實(shí)驗，RNA穩定性測定， RNA下拉實(shí)驗 ，RIP-PCR檢測，ATP含量檢測，LD含量檢測，ATP酶活性檢測，細胞外酸化速率測定（能發(fā)高分文章的秘訣）。
結果
1、CRC細胞和組織中lncRNA的失調與IMP1/2/3的表達相關(guān)
在CRC組織中，只有IMP2表達量比較高，且遠高于IMP1和IMP3（圖1b）。同樣發(fā)現IMP2在7個(gè)CRC細胞系（(LOVO，CACO2，SW48，SW480，HT29，HCT116和 SW620)中的表達量也高于結直腸上皮細胞中的表達量（圖1c）。而m6A斑點(diǎn)實(shí)驗檢測結果表明，總m6A在CRC細胞系（特別是HCT116、SW620和HT29細胞系）中的水平要高于正常結直腸上皮細胞（圖1d）。這和之前對IMP2的功能研究結論一致，即穩定RNA的表達，增加總RNA的m6A水平。
然后分析了m6A閱讀蛋白IMP1/2/3的RNA免疫沉淀測序（RIP-seq)數據以及TCGA中的數據，獲得了7個(gè)候選的lncRNA。其中ZFAS1、SNHG15和CRNDE表現出明顯的高表達（圖1e）。在CRC細胞中，ZFAS1表現出最明顯的高表達（圖1f）。在IMP1/2/3和ZFAS1之間計算相關(guān)性，發(fā)現ZFAS1和IMP2之間存在明顯的正相關(guān)（圖1g）。
為了研究IMP2在ZFAS1表達中的潛在作用及其相關(guān)的m6A甲基化水平，本文進(jìn)行了組織微陣列（TMA）、RNA原位雜交（ISH）和免疫組化（IHC）檢測，分析CRC組織樣本和對應的癌旁組織（n=144）中IMP、m6A和ZFAS1的表達（圖1h）。值得注意的是，在CRC組織中，IMP2、ZFAS1的表達和m6A的甲基化水平急劇增加（圖1i）。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)模式分析，表明IMP2和ZFAS1的表達和m6A水平呈現正相關(guān)性（圖1j）。
為了進(jìn)一步探討這些指標在隊列中作為獨立預后因素的臨床效用，對144例CRC組織和癌旁組織進(jìn)行了秩和檢驗和多變量cox回歸分析，發(fā)現IMP2表達量的升高顯著(zhù)縮短了總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS），m6A甲基化的高表達與不良的OS和DFA顯著(zhù)相關(guān)，而ZFAS1表達量高的CRC患者的OS急劇下降。DFS也明顯下降（圖1k）。說(shuō)明IMP2、m6A和ZFAS1的表達與CRC患者的生存狀況有著(zhù)明顯的相關(guān)性。
總之，這些結果表明IMP2在CRC細胞和組織中高表達，并伴隨著(zhù)相關(guān)的m6A甲基化水平和ZFAS1的表達。這些指標也表示了其作為獨立的預后預測因子的潛在功能，可用于未來(lái)的CRC評估和治療的生物標志物。
圖1（上下滑動(dòng)查看）
2、CRC細胞中IMP2通過(guò)直接與ZFAS1的m6A位點(diǎn)結合促進(jìn)ZFAS1的穩定性
為了探索在CRC腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，IMP2介導的m6A甲基化穩定性及其相關(guān)的ZFAS1表達的關(guān)鍵生物學(xué)特征，在HCT116和SW620細胞系中檢測干擾IMP2后的IMP2和ZFAS1的表達。結果表明異位IMP2的表達明顯地增強了ZFAS1和IMP2的表達。然而通過(guò)qPCR定量分析發(fā)現IMP2的敲除抑制了HCT116和SW620中ZFAS1和IMP2的表達（圖2b）。在IMP2敲除的CRC細胞中，通過(guò)上調ZFAS1的表達來(lái)進(jìn)行拯救實(shí)驗，通過(guò)qPCR發(fā)現ZFAS1的表達的確得到了恢復（圖2c）。更重要的是，RNA穩定性分析進(jìn)一步確定了與空載體處理的細胞相比，IMP2敲除或在不同時(shí)間點(diǎn)(0,2,4,6 h)進(jìn)行放線(xiàn)菌素D治療的HCT116和SW620 細胞中ZFAS1 RNA的半衰期是減少的（圖2d）。這些發(fā)現說(shuō)明IMP2作為一個(gè)m6A閱讀蛋白對ZFAS1有穩定作用。
為了驗證IMP2和ZFAS1之間的直接關(guān)聯(lián)，初步分析了FLAG標記的IMP1/2/3的RIP-seq數據，發(fā)現和對照相比，異位IMP2的表達極大地豐富了HEK293T細胞的內源性ZFAS1（圖2e)。此外，RNA結合蛋白的數據說(shuō)明IMP2蛋白有一個(gè)特定的結合域可以識別ZFAS1中的m6A motif（圖2f）。為了進(jìn)一步驗證IMP2和ZFAS1結合位點(diǎn)的可靠性，進(jìn)行了共定位的ISH和免疫熒光（IF）檢測，結果發(fā)現ZFAS1和IMP2的表達分布相一致，主要結合位點(diǎn)在HCT116和SW620的細胞質(zhì)中，部分在細胞核中（圖2j）。RIP分析發(fā)現相比對照組，用m6A抗體富集得到了更高表達的ZFAS1（圖2k），RNA下拉實(shí)驗說(shuō)明了通過(guò)攜帶m6A motif與IMP2蛋白特定結構域可以直接結合（圖2m）。利用qPCR驗證IMP2 KH3-4的WT和Mut載體處理后的HEK293T細胞中ZFAS1的表達，發(fā)現表達量顯著(zhù)減少（圖2i），說(shuō)明IMP2 KH3-4結構域可以與ZFAS1直接相互作用。
以上數據結果說(shuō)明IMP2通過(guò)KH3-4直接與ZFAS1上的m6A位點(diǎn)結合，并增強了ZFAS1的穩定性（圖2a）。
圖2（上下滑動(dòng)查看）
3、IMP2通過(guò)調節ZFAS1在CRC細胞中的表達來(lái)調控生物學(xué)特性
為了進(jìn)一步明確在CRC細胞中IMP2和ZFAS1特異性的調控模式，首先通過(guò)MTT實(shí)驗（圖3b）和細胞克隆實(shí)驗（CFA）（圖3c）分析了干擾IMP2表達后的HCT116和SW620細胞系的細胞增殖能力和細胞克隆能力。結果發(fā)現異位IMP2的表達顯著(zhù)促進(jìn)了CRC細胞的生長(cháng)和克隆能力，而IMP2的耗竭抑制了CRC細胞的增殖。此外還檢測了細胞侵襲能力（圖3d），發(fā)現在沉默IMP2時(shí)，細胞的遷移受到了明顯的抑制，而IMP2的過(guò)表達極大地提高了HCT116和SW620細胞系的侵襲能力。還發(fā)現IMP2的敲除增加了CRC細胞的凋亡率，IMP2的過(guò)表達會(huì )抑制CRC細胞的凋亡率（圖3e）。后續通過(guò)拯救實(shí)驗表明ZFAS1的過(guò)表達逆轉了對CRC細胞的促進(jìn)作用，包括細胞增殖能力、細胞克隆能力、細胞遷移能力和細胞凋亡率（圖3f-i）。
這些結果說(shuō)明IMP2通過(guò)促進(jìn)ZFAS1的穩定性和表達來(lái)增加CRC細胞的增殖，抑制CRC細胞的凋亡，并促進(jìn)細胞侵襲和轉移，而IMP2對細胞表型的影響可以通過(guò)調節ZFAS1的表達來(lái)恢復。
圖3（上下滑動(dòng)查看）
4、在CRC細胞中鑒定到OLA1是IMP2穩定的的ZFAS1的關(guān)鍵靶點(diǎn)
為了進(jìn)一步挖掘影響CRC細胞表型和功能的ZFAS1的下游靶點(diǎn)，在CRC細胞中進(jìn)行了相關(guān)的功能研究。首先通過(guò)熱圖分析發(fā)現了與ZFAS1過(guò)表達正相關(guān)的潛在下游靶點(diǎn)，并通過(guò)公開(kāi)數據集進(jìn)行驗證（圖4a，b)。交集結果中發(fā)現了線(xiàn)粒體能量代謝相關(guān)基因OLA1，進(jìn)一步通過(guò)qPCR檢測發(fā)現與對照細胞相比，OLA1在7個(gè)CRC細胞系中顯著(zhù)過(guò)表達（圖4c）。同樣在CRC組織和癌旁組織的qPCR結果中發(fā)現，OLA1的表達在CRC組織中更高（圖4d）。結果說(shuō)明OLA1在CRC的組織和細胞樣本中都是高表達的，且OLA1和ZFAS1的表達模式高度一致。
隨后采用TMA和IHC檢測OLA1的表達（圖4e），通過(guò)RCO曲線(xiàn)評估OLA1的低/高表達，發(fā)現與對照組相比，CRC組織中觀(guān)察到明顯的OLA1表達，表現出致癌基因的特性（圖4e，f）。且OLA1與ZFAS1的表達存在正相關(guān)性（圖4g）。與臨床數據做相關(guān)性分析，結果表明OLA1低表達的患者占比較高（圖4h），OLA1高表達的CRC患者的DFS和OS時(shí)間明顯縮短了（圖4i）。后續針對OLA1是否是ZFAS1的下游靶點(diǎn)做驗證，IMP2沉默/過(guò)表達不僅降低/增加了OLA1 mRNA的表達，而且降低/增加了OLA1蛋白的表達。但是IMP2對OLA1的影響可以被ZFAS2完全逆轉（圖4j-l）。
這些發(fā)現表明在CRC細胞和組織中，OLA1受到被m6A修飾和m6A穩定的ZFAS1表達的正向調控，進(jìn)一步的預后評估揭示OLA1可以成為預測CRC臨床結果的一個(gè)潛在生物標志物。
圖4（上下滑動(dòng)查看）
5、ZFAS1通過(guò)與OLA1的OBG型功能域結合增強OLA1的活性并激活糖酵解代謝
接下來(lái)通過(guò)ISH和IF實(shí)驗證明ZFAS1和OLA1在CRC細胞中的共定位。結果表明，OLA1和ZFAS1不僅持續分布在HCT116和SW620細胞系的細胞質(zhì)中，而且還分布在細胞核中（圖5b）。為了確定ZFAS1是否與OLA1有直接的結合位點(diǎn)，并研究ZFAS1中關(guān)鍵的m6A位點(diǎn)對OLA1的影響，本研究將ZFAS1的三個(gè)A堿基替換成U堿基，并重新預測了
ZFAS1的三級結構。有趣的是，ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都是與OLA1的OBG型功能域結合，而且ZFAS1-WT和OLA1的結合強度遠遠高于ZFAS1-Mut和OLA1的結合強度（圖5c）。RNA下拉實(shí)驗表明，ZFAS1-WT的探針能顯著(zhù)下拉OLA1，而當ZFAS1的m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，ZFAS1-WT不能再下來(lái)OLA1（圖5d）。所有結果說(shuō)明OLA1蛋白特異性結構域能和含有ZFAS1-OLA1結合motif之間有直接結合作用。此外，OLA1表達的減少導致其ATP酶活性的降低，而ZFAS1的過(guò)度表達可以恢復OLA1的ATP酶活性。但是當ZFAS1的關(guān)鍵m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，ZFAS1對OLA1的ATP酶活性的恢復作用也消失了（圖5e）。這也證明了ZFAS1對OLA1的ATP酶活性的促進(jìn)作用取決于ZFAS1和OLA1的結合。
接下來(lái)探索OLA1的ATP酶活性的變化對CRC細胞能量代謝的影響，研究了HCT116和SW620細胞系中乳酸和ATP的含量。發(fā)現OLA1表達的減少不僅可以降低乳酸的積累，還可以減少細胞中ATP的含量（圖5f，g）。通過(guò)細胞外酸化率的測定檢測OLA1的變化對CRC細胞的糖酵解代謝能力的影響，發(fā)現OLA1表達的減少可以顯著(zhù)降低CRC細胞的糖酵解代謝能力，ZFAS1-WT可以恢復OLA1表達減少對CRC細胞糖酵解代謝能力的影響（圖5h）。
總之，ZFAS1可以直接與OLA1的OBG型功能域結合，從而增強OLA1的ATP水解能力，促進(jìn)乳酸的積累，激活了CRC細胞的糖酵解途徑，最終促進(jìn)CRC能量的釋放（圖5a）。
圖5（上下滑動(dòng)查看）
6、IMP2-ZFAS1-OLA1信號軸影響到線(xiàn)粒體能量代謝
通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察到IMP2沉默后線(xiàn)粒體形態(tài)發(fā)生變化，即發(fā)現CRC細胞中線(xiàn)粒體明顯腫脹和受損，IMP2沉默后線(xiàn)粒體的形態(tài)回復正常（圖6b）。同時(shí)IMP2的過(guò)度表達促進(jìn)了HK2（糖酵解的關(guān)鍵蛋白）的表達，抑制了PDHA1（氧化磷酸化的關(guān)鍵蛋白）的表達（圖6c）。然而ZFAS1沉默/過(guò)度表達和IMP2過(guò)表達/沉默后，HK2和PDHA1的表達水平得到恢復（圖6d）。
IMP2的過(guò)度表達明顯增強了乳酸和ATP的釋放，還發(fā)現IMP2敲除導致乳酸和ATP含量的釋放大幅度減少，而ZFAS1可以完全逆轉IMP2的影響（圖6e，f）。細胞能量代謝檢測進(jìn)一步表明IMP2沉默減弱了細胞的糖酵解代謝能力，而ZFAS1可以逆轉IMP2沉默對糖酵解水平降低的影響（圖6g，h）。
總而言之，這些發(fā)現表明IMP2以依賴(lài)m6A的方式穩定ZFAS1的表達，與OLA1介導的線(xiàn)粒體能量代謝有著(zhù)重要的聯(lián)系。
圖6（上下滑動(dòng)查看）
7、IMP2在體內通過(guò)穩定ZFAS1促進(jìn)細胞增殖
利用異體移植模型驗證IMP2-ZFAS1-OLA1信號軸在體內的生物學(xué)功能（圖7a），預后評估顯示異種移植小鼠在與shIMP2和ZFAS1載體共同轉染后，生存時(shí)間明顯縮短（圖7b），表明IMP2和ZFAS1在CRC預后評估中具有協(xié)同作用。此外，轉染shIMP2載體的異種移植小鼠中，腫瘤體積、大小和重量都明顯減少；然而，在與shIMP2和ZFAS1載體共同轉染后，腫瘤體積、大小和重量急劇增加（圖7c-e）。實(shí)驗結果說(shuō)明在異種移植模型中，ZFAS1的過(guò)表達明顯地逆轉了IMP2沉默對腫瘤生長(cháng)的抑制作用（圖7f）。
總之，體內實(shí)驗表明，通過(guò)利用m6A誘導的穩定性的IMP2與ZFAS1/OLA1軸的相互作用，IMP2敲除抑制了異種移植模型的腫瘤生長(cháng)和惡化。
圖7（上下滑動(dòng)查看）
結論
本文揭示了IMP2-ZFAS1-OLA1信號軸在CRC腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的新調節機制。在CRC細胞中，IMP2正向調節lncRNA ZFAS1。異位IMP1增強了ZFAS1的穩定性和表達，而敲除IMP2會(huì )抑制ZFAS1的表達?；赗NA識別的motif，IMP2蛋白的KH3-4結構域在功能上被認為是直接與RNA結合的結構域，促進(jìn)了ZFAS1中+843 m6A位點(diǎn)的RNA識別。此外，ZFAS1直接與OLA1結合，增強了OLA1的ATP酶活性，介導了線(xiàn)粒體的能量代謝，包括ATP水解和糖酵解代謝的生物過(guò)程，并最終影響到CRC細胞命運?？偟膩?lái)說(shuō)，本文在結直腸癌預防和治療中發(fā)現了一個(gè)新的信號軸，即識別到新的靶點(diǎn)和將m6A表觀(guān)遺傳修飾與線(xiàn)粒體能量轉換串聯(lián)起來(lái)。
圖8（上下滑動(dòng)查看）
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參考文章：
Lu S, Han L, Hu X, et al. N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021;14(1):188. Published 2021 Nov 7. doi:10.1186/s13045-021-01204-0
京公網(wǎng)安備 11011302003368號