百邁客單細胞和空間轉錄組測序
單細胞轉錄組測序（scRNA）是在單細胞水平進(jìn)行高通量基因表達譜檢測，對復雜細胞群深入分析，表征單個(gè)細胞的表達譜，避免單個(gè)細胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細胞的均質(zhì)化覆蓋。
空間轉錄組（ST）是以高空間分辨率解析RNA-seq數據的技術(shù)，實(shí)現解析單個(gè)組織切片中的所有mRNA，從而能夠定位和區分功能基因在特定組織區域內的活躍表達信息，對于癌癥、免疫、腫瘤免疫相互作用，組織微環(huán)境，神經(jīng)和發(fā)育等領(lǐng)域，有著(zhù)令人期待的應用前景。
單細胞和空間轉錄組技術(shù)原理對比：
英文題目：A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers
中文題目：人類(lèi)乳腺癌的單細胞和空間分辨率圖譜
發(fā)表雜志：nature genetics
影響因子：24.36
DOI：10.1038/s41588-021-00911-1
乳腺癌是一個(gè)復雜的細胞生態(tài)系統，目前人類(lèi)對它們細胞組成和組織的了解是有限的。此項研究中作者對人類(lèi)乳腺癌進(jìn)行單細胞和空間分辨轉錄組學(xué)分析，并開(kāi)發(fā)了一種固有亞型分類(lèi)的單細胞方法來(lái)揭示復發(fā)性腫瘤細胞的異質(zhì)性。利用轉錄組和空間轉錄組進(jìn)行免疫分型，最終提供了高分辨率的免疫圖譜和乳腺癌細胞結構的全面轉錄圖譜。
研究背景
目前對人類(lèi)乳腺癌細胞異質(zhì)性和組織結構的理解主要來(lái)源于組織學(xué)、批量測序、低維假 設研究和實(shí)驗模型系統。不同的細胞亞群與腫瘤微環(huán)境(TME)中的細胞以及與疾病狀態(tài)之間的關(guān)系仍未明確。單細胞RNA測序（scRNA-scq）則為系統描述腫瘤的細胞景觀(guān)提供了顯著(zhù)的新機會(huì )，并為揭示了細胞生物學(xué)、疾病病因學(xué)和藥物反應提供了新見(jiàn)解。最近的研究了來(lái)自數百名患者的數百萬(wàn)細胞，以探究乳腺癌細胞類(lèi)型和生態(tài)系統。因此，需要一個(gè)更詳細的高分子分辨率的乳腺腫瘤轉錄圖譜，進(jìn)一步界定疾病的分類(lèi)，識別細胞的異質(zhì)性，從而確定細胞分類(lèi)。scRNA-seq和stRNA-seq相關(guān)數據則可以更好的確定TME中的細胞是如何組織成功能單位的。
實(shí)驗方法
材料：
(1) 單細胞轉錄組：26個(gè)腫瘤原發(fā)灶組織，包括11個(gè)ER+、5個(gè)HER2+和10個(gè)TNBC患者
(2) 空間轉錄組：6個(gè)腫瘤原發(fā)灶組織，包括來(lái)自本研究scRNA-seq隊列的2個(gè)ER+（CID4535和CID4290）和2個(gè)TNBC（CID44971 和 CID4465），以及2個(gè)在其它實(shí)驗室中處理的TNBC（1142243F 和 1160920F）
方法：單細胞轉錄組測序、空間轉錄組測序
研究結果
1. 人類(lèi)乳腺癌的高分辨率細胞圖譜
為了闡明乳腺癌的細胞結構，作者通過(guò)scRNA-seq分析了26個(gè)原發(fā)腫瘤，包括11個(gè)ER+， 5個(gè)HER2+和10個(gè)TNBCs。共對130246個(gè)單細胞數據進(jìn)行了分析注釋?zhuān)▓Dla，b）。主要的細胞類(lèi)型代表了所有腫瘤和臨床亞型（圖lc）。UMAP顯示腫瘤間質(zhì)和免疫細胞聚集在一起。在腫瘤人群中，大量大規?；蚪M重排被觀(guān)察到。這揭示了患者獨特的拷貝數變化和乳腺癌中常見(jiàn)的變化，如腔癌中chrlq增加和基底樣乳腺癌中chr5q丟失。
2. SCSubtype: scna -seq數據的固有亞型
由于無(wú)監督聚類(lèi)不能發(fā)現腫瘤間復發(fā)的腫瘤細胞基因表達特征，作者嘗試使用建立的PAM50方法對細胞進(jìn)行分類(lèi)，并開(kāi)發(fā)了一種兼容scRNA -seq的方法來(lái)進(jìn)行固有分子亞型劃分。作者使用了1100個(gè)乳腺腫瘤的癌癥基因組圖譜（TCGA）數據集和大約2000個(gè)固有乳腺癌基因列表，對樣本進(jìn)行層次聚類(lèi)。最終確定4組基因，這些基因將定義單細胞衍生的分子亞型。作者將這些基因定義為 “SCSubtypc”基因標記。
SCSubtype顯示，20個(gè)樣本中有13個(gè)樣本的腫瘤細胞低于90%屬于1個(gè)分子亞型，而只有1個(gè)腫瘤顯示完全同質(zhì)（圖2b） 。在一些管腔和HER2E腫瘤中，SCSubtype預測了少量的基底樣細胞，由免疫組學(xué)驗證（圖2c）。其應用進(jìn)一步證明了低細胞性小葉癌的能力，主要為L(cháng)umB和LumA細胞的混合物（圖2b），這與臨床IHC結果一致。
3. 復發(fā)性基因模塊驅動(dòng)腫瘤細胞異質(zhì)性
接下來(lái)作者又以一種無(wú)監督的方式研究了驅動(dòng)腫瘤內轉錄異質(zhì)性（ITTH）的生物途徑，對至少50個(gè)腫瘤細胞進(jìn)行整合聚類(lèi)，生成574個(gè)ITTH基因標記。并識別出七個(gè)群體，即“基因模塊”（GMs）?；蚣患b定出這些GMs共有的和獨特的功能特征（圖2e）。GM4在MKI67、PCNA和CDK1等基因驅動(dòng)的細胞周期和增殖標記中具有獨特的富集作用。GM3主要富集干擾素應答、抗原呈遞和上皮-間充質(zhì)轉化。GM1和GM5表現出雌激素反應途徑的特征，而GM1在缺氧、腫瘤壞死因子α和p53信號轉導和細胞凋亡中也表現出富集。
對于每個(gè)腫瘤細胞，作者計算了7個(gè)GMs的特征
（圖2e）。GM4在MKI67、PCNA和CDK1等基因驅動(dòng)的細胞周期和增殖標記中具有獨特的富集作用。GM3主要富集干擾素應答、抗原呈遞和上皮-間充質(zhì)轉化。GM1和GM5表現出雌激素反應途徑的特征，而GM1在缺氧、腫瘤壞死因子α和p53信號轉導和細胞凋亡中也表現出富集。
對于每個(gè)腫瘤細胞，作者計算了7個(gè)GMs的特征評分，并使用層次聚類(lèi)來(lái)識別細胞相關(guān)性。這清楚的將腫瘤細胞進(jìn)行了分組，減少圖ld-f中所示的巨大腫瘤間變異性。一些模塊與SCSubtype相關(guān)聯(lián)，而其他模塊則顯示了更多樣化的子類(lèi)型關(guān)聯(lián)（圖2f，g）。最后，作者使用基于GM的細胞狀態(tài)分配來(lái)了解腫瘤細胞的瘤內異質(zhì)性。類(lèi)似于SCSubtype（圖2b），看到了與腫瘤亞型廣泛一致但不受腫瘤亞型限制的細胞異質(zhì)性證據（圖2h）。SCSubtype和GM分析為腫瘤性ITTH的分類(lèi)提供了互補的新方法，并進(jìn)一步證明大多數腫瘤中癌細胞表現出不同的表型。
4. 乳腺癌的免疫環(huán)境
高分辨率下檢查乳腺腫瘤的免疫微環(huán)境，作者重新聚集免疫細胞，以識別T細胞、固有淋巴細胞、髓樣細胞、B細胞和漿細胞。通過(guò)細胞轉錄組和表位測序(CITE-seq)對4個(gè)樣本進(jìn)行免疫表型分析，并進(jìn)行基于錨點(diǎn)的整合，將蛋白表達水平轉移到其余病例中，結果顯示與實(shí)驗測量值高度相關(guān)。
5. 淋巴細胞和先天淋巴樣細胞
作者又在患者中發(fā)現了18個(gè)T細胞和先天淋巴細胞簇（圖3a）。在這5個(gè)CD8集群中，由3個(gè)高表達抑制性檢查點(diǎn)分子包括 LAG3、PDCDI 和 TIGIT和2個(gè)低表達 IFNG 和 TNF的CD8 + T細胞組成。另外還發(fā)現了由1型干擾素(IFN-I)信號和增殖驅動(dòng)的兩個(gè)簇，它們都由CD4+和CD8+ T細胞組成。通過(guò)αβ T細胞受體和NK標記的表達，作者還鑒定了自然殺傷細胞(NK)和自然殺傷T (NKT)樣細胞。
在TNBC樣本中，IFITl/c6、LAG3/c8 和MKI67/C11的T細胞比例更高（圖3c）。值得注意的是，在TNBC中LAG3/C8消耗的CD8亞群顯著(zhù)表達PD-1、LAG3、CD27和CD70配受體，可增強T細胞的細胞毒性（圖4f）。在不同的臨床亞型中，檢查點(diǎn)分子表達的差異更為明顯，包括在非免疫細胞(如CAFs)上。這些數據提供了對每種亞型疾病最適合的免疫治療策略的見(jiàn)解。
6. 骨髓細胞
骨髓細胞形成13個(gè)簇，可在所有腫瘤中以不同頻率被識別（圖4a）。單核細胞形成三個(gè)簇，其中Mono:FCGR3A群體形成了一個(gè)小而獨特的簇，以CDI6蛋白高表達為特征（圖4b，c）。作者鑒定了表達CLEC9A或CD1C的傳統樹(shù)突狀細胞（cDCs），表達 IRF7和 LAMP3，這在之前的乳腺癌單細胞研究中未見(jiàn)報道。巨噬細胞形成6個(gè)簇，其中一個(gè)簇具有先前“M1-like”表型相關(guān)的特征，還有兩個(gè)簇類(lèi)似于“M2-like”表型，所有這些簇都與之前在乳腺癌中描述的TAMs有一些相似之處。值得注意的是，作者發(fā)現了在傳統的M1/M2分類(lèi)之外的兩個(gè)新的巨噬細胞群體（圖4a-c）。這些細胞與最近報道的脂質(zhì)相關(guān)巨噬細胞(LAMs)在肥胖小鼠和人類(lèi)中擴增的轉錄組相似性非常高。同時(shí)還觀(guān)察到HER2+腫瘤中LAMI:FABP5細胞的比例大幅降低(圖4d)， 這表明獨特的腫瘤基因組學(xué)特征或微環(huán)境調節LAM1/2的命運。雖然RNA編碼PD-L1和PD-L2在Mac:CXCL10和DCLAMP3髓系群體中高度共表達(圖4f)，但CITE-seq 數據的分析顯示，PD-L1和 PD-L2蛋白表達在Mac:CXCL10、LAM1:FABP5、LAM2:AP0E和DC:LAMP3簇中分布更廣(圖4b和圖7g)，突出LAM1/2作為免疫調節分子的重要來(lái)源。
7. 基質(zhì)亞類(lèi)類(lèi)似于不同的分化狀態(tài)
在基質(zhì)室中，作者鑒定了三種主要的細胞類(lèi)型(圖5a，b)。Monocle2的偽時(shí)間軌跡分析揭示了5種CAF狀態(tài)。狀態(tài)1(s1)具有高表達的間充質(zhì)干細胞(MSCs)和炎性樣CAFs (iCAFs)特征。當細胞向分化狀態(tài)s4和s5過(guò)渡時(shí)，這些標記物的表達減少，這種分化狀態(tài)通過(guò)增加ACTA2 (aSMA)、TAGLN、FAP和COL1A1的表達和富集ECM相關(guān)通路而類(lèi)似于肌成纖維細胞樣CAF狀態(tài)。
對于PVL細胞，作者識別出三種狀態(tài)（圖5e）。PVL sl和s2表達與干細胞、未成熟周細胞和粘附分子相關(guān)的標志物相關(guān)。s2的分支由RGS5、CD248和THY1確定。與基因表達一致，CITE-seq顯示PVL早期s1和s2中細胞表面CD90（THY1）和整合素分子CD49a 、CD49d的富集（圖5i，j）。當細胞轉移到PVL s3時(shí)，這些標記的表達減少，而PVL s3則富含與收縮相關(guān)的基因和平滑肌表型相關(guān)的通路（圖5），揭示PVL s3細胞在IHC檢測中一直被誤分類(lèi)為CAFs。
接下來(lái)，作者確定了三種內皮狀態(tài)（圖5g）。當細胞分成兩種狀態(tài)時(shí)，這些標記物隨著(zhù)偽時(shí)間的推移而減少，這兩種狀態(tài)都伴有內皮細胞標記物DLL4的表達升高（圖5h）。內皮細胞s2以RGS5和ESM1區分，而s3表達細胞遷移和血管生成調節因子。由于血管的生成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及內皮柄細胞和頂端細胞之間的轉換。在臨床亞型和三個(gè)正常乳腺組織樣本中鑒定出相似的CAF、PVL和內皮細胞狀態(tài)，表明它們可能是在TME中經(jīng)歷重構的固有細胞類(lèi)型。
8. 對乳腺癌異質(zhì)性進(jìn)行空間映射
為了深入了解組織細胞類(lèi)型，作者對6個(gè)樣本進(jìn)行了空間轉錄組學(xué)分析（圖6a），同時(shí)作者還將其與scRNA-seq數據進(jìn)行了匹配分析（圖6b）。在6個(gè)病例中，通過(guò)立體鏡和病理學(xué)識別出癌細胞的位置，然后檢查每個(gè)位置的7個(gè)GM標記，這揭示了在TNBC病例中 GM3和GM4的預期富集以及在ER +病例中GM1和GM5的預期富集。這揭示了兩個(gè)主要的星系團GM1、GM3、GM5和GM6和另一個(gè)星系團的GM2和GM4在6個(gè)病例中大多是保守的（圖 6d）。有趣的是，GM3和GM4在所有樣本中顯示出強烈的負相關(guān)（圖6e-g），表明這些不同的癌癥表型發(fā)生在乳腺癌相互排斥的區域。
9. 繪制新的異型細胞相互作用
雖然一些研究表明間充質(zhì)細胞在調節抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，但基質(zhì)細胞和免疫細胞之間的相互作用尚未在組織中被闡明。作者在6例病患中發(fā)現5例肌成纖維細胞樣CAFs和iCAFs 之間存在中度負相關(guān)性（圖7a-c）。CAF定位在7個(gè)HER2+乳腺腫瘤的獨立空間轉錄組數據是一致的，表明這種關(guān)系在不同的臨床亞型中是保守的（圖7a）。與上述iCAFs的免疫調節特性一致的是，在兩項研究中，iCAFs均與多個(gè)淋巴細胞群體共定位（圖7a,d，c）。在6個(gè)樣本中，肌成纖維細胞樣CAFs與CD8+T細胞相關(guān)（圖7a），揭示與高TIL浸潤或免疫炎癥表型的浸潤性乳腺癌的功能相關(guān)。通過(guò)整合信號預測和細胞鄰近性，這些數據突出了 CAFs直接調控免疫細胞的相關(guān)候選因子。
之前，作者定義了巨噬細胞狀態(tài)LAM1，LAM2和Mac:CXCL10/c9，它們是具有高表達的免疫調節分子。在所有的局部Visium病例中，LAM1和LAM2細胞均存在于浸潤性腫瘤區域；然而，LAM2也存在于高基質(zhì)細胞、脂肪細胞和淋巴細胞的形態(tài)學(xué)區域。在所有三個(gè)亞型的8個(gè)腫瘤中，LAM2細胞與CD4+和CD8 + T細胞正相關(guān)（圖7a）。多個(gè)腫瘤的LAM2細胞和CD4+/CD8+T細胞富集的spots共同表達PD-L1/PD-1和PD-L2/PD-1，表明這些細胞可能具有免疫調節的功能相關(guān)性。
10. 乳腺腫瘤生態(tài)型與患者生存相關(guān)
作者在26個(gè)腫瘤中觀(guān)察到顯著(zhù)的變異和細胞頻率的重復模式，并從單細胞數據集中估計細胞組分，發(fā)現捕獲的細胞組分和預測的比例之間具有良好的整體相關(guān)性，大多數細胞類(lèi)型出先顯著(zhù)相關(guān)性。作者還觀(guān)察到在匹配bulk-PAM50分類(lèi)的腫瘤中，聚類(lèi)顯示9個(gè)細胞組成相似的腫瘤簇（“生態(tài)型”）（圖8a-c）。這些生態(tài)型與腫瘤亞型、sc亞型細胞和主要細胞類(lèi)型的多樣性相關(guān)（圖8a）。Ecotype 3（E3）在含有Basal_SC等細胞和基底樣PAM50亞型的腫瘤中富集（圖8a，b）。El、E5、E6、E8和E9主要由管腔細胞組成。E4對與抗腫瘤免疫相關(guān)的免疫細胞高度富集（圖8a）。E2 主要由 LumA 和正常樣腫瘤組成（圖8a,b）。
在預后方面，E2腫瘤患者預后較好（圖8d，e）， E3腫瘤患者5年生存率較差（圖8d）， 這與已知的基底樣和高增殖腫瘤的不良預后相一致。E7預后也較差，以HER2E腫瘤為主；E4 也有相當大的比例HER2E和基底樣腫瘤（圖8b），但這些患者的預后明顯好于E7，可能是抗腫瘤免疫細胞浸潤的結果。通過(guò)對整合基因組群與生態(tài)型之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究，發(fā)現E3中來(lái)自整合基因組群10的癌癥比例很高，5年生存率同樣很低。E7有很高比例的ERBB2擴增和HER2E整合基因組簇5。然而大多數生態(tài)型與特定的整合基因組簇或PAM50亞型沒(méi)有明確的關(guān)聯(lián)，這反映了基質(zhì)細胞和免疫細胞在生態(tài)型中的作用。
小結
在此項研究中，作者主要將乳腺腫瘤細胞結構分為三個(gè)層次。首先，詳細的細胞分類(lèi)，包括新的細胞類(lèi)型和狀態(tài)，以及表征細胞異質(zhì)性的新方法。第二，腫瘤內細胞位置和相互作用的空間圖譜，揭示組織內腫瘤和宿主細胞表型的協(xié)調性及細胞之間的空間關(guān)系。第三，利用反褶積，作者還觀(guān)察了具有相似細胞類(lèi)型比例和預后相關(guān)性的腫瘤組，稱(chēng)為生態(tài)型，通常由特定的共分離細胞群驅動(dòng)。未來(lái)的工作將研究組織結構和腫瘤生態(tài)型的分子機制，旨在解釋它們在臨床結果上的差異，并研究腫瘤生態(tài)型是否可以用于個(gè)體化治療。
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