英文標題：Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota
機構：加拿大卡爾加里大學(xué)微生物學(xué)、免疫學(xué)和傳染病學(xué)系
發(fā)表期刊：Nature Microbiology
影響因子：15.54
發(fā)表時(shí)間：2020 Jan 20
摘要
作者將擴增子測序與富集培養宏基因組測序相結合研究人類(lèi)微生物群落。以肺囊性纖維化為例，平均培養了82.13%的可操作分類(lèi)單元（OTUs），占痰液樣本直接測序所鑒定的相對豐度的99.3%，更重要的是，與直接測序相比，富集培養方法鑒定的OTUs多了63.3%。作者開(kāi)發(fā)了平板覆蓋算法（PLCA），以確定富集培養平板的代表性子集，從而在該子集上進(jìn)行宏基因組研究。與不依賴(lài)培養的方法相比，可以恢復更多的物種多樣性（包含更好的低豐度物種的組裝基因組，MAGs），更長(cháng)的重疊群和更好的功能注釋結果。PLCA算法也可以應用于此前發(fā)布的腸道菌群數據集，富集培養分子圖譜可以更好的了解微生物菌群在人類(lèi)健康和疾病中的作用。
背景介紹
擴增子測序（如16S rRNA基因）簡(jiǎn)單快速地鑒定出微生物菌群組成和相對豐度，而宏基因組測序除了物種之外，還可以評估群落的基因組分、潛在功能，測序數據的有效性，取決于短序列拼接成重疊群的情況。拼接質(zhì)量受菌群的復雜度、測序技術(shù)、宿主DNA污染比例等影響。宏基因組測序對于宿主DNA比例較高的樣本類(lèi)型（如皮膚、組織、呼吸道）來(lái)講是一個(gè)挑戰。
實(shí)驗方法
基于作者之前的研究（肺囊性纖維化患者的痰液樣本富集培養擴增子測序鑒定到48科細菌，其中43科可以培養），收集到的樣本分別在有氧和厭氧條件下，經(jīng)過(guò)13種不同的培養基富集。同時(shí)，對這些樣本直接進(jìn)行16S rRNA測序，富集培養后的共26個(gè)樣本也進(jìn)行16S測序，同時(shí)挑選了8個(gè)富集后的樣本進(jìn)行宏基因組測序。
圖1 富集培養宏基因組測序工作流程
實(shí)驗結果
肺囊性纖維化痰液微生物菌群大多是可培養的，富集培養增加OTU恢復率
作者判斷OTU可培養的條件：1）至少10條序列；2）至少1個(gè)富集板中回收到且豐度比例至少為0.01%。直接測序鑒定到的OTU中82.13%是可培養的，這些可培養的在所有直接測序的樣本中平均豐度比例為99.3%（圖2a），富集培養擴增子測序比直接測序獲得更多的OTUs（圖2b），如樣本1恢復到49個(gè)OTUs，其中42個(gè)在富集培養中也恢復到，富集培養還恢復了額外的124個(gè)OTUs（圖2a）。
圖2 肺囊性纖維化痰液微生物菌群大多是可培養的
培養OTU恢復率取決于培養基類(lèi)型和是否有氧
培養基類(lèi)型和培養環(huán)境對于微生物菌群多樣性是重要的。富集培養和直接16S測序結果中物種分布和β多樣性結果表明有氧和厭氧條件促進(jìn)了不同的物種恢復（圖3a,b）。不同培養基類(lèi)型的物種進(jìn)行聚類(lèi)顯示選擇性培養和非選擇性培養的重要性（圖3c），有些屬的生長(cháng)模式也存在OTU依賴(lài)差異（如普氏菌屬，圖3d）。作者在臨床實(shí)驗室常用的4種典型培養條件的基礎上，擴展了培養條件，獲得將近2倍的OTUs（圖3e）。富集培養的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以從凍存細菌中回收感興趣的微生物。嗜麥芽窄食單胞菌從兩個(gè)凍存的脫脂牛奶塊中分離得到，其相對豐度比例很低（1.3%和1.5%），牛奶塊在特定的培養基類(lèi)型培養（圖3f）。
圖3 通過(guò)培養富集物種分類(lèi)多樣性增加
PLCA算法為培養富集的宏基因組測序提供信息
肺部蘊藏了微生物菌群，每個(gè)個(gè)體是有差異的，雖然不同的培養條件是捕獲每個(gè)個(gè)體多樣性的必要條件，但是并不意味著(zhù)收集到的每個(gè)樣品都需要進(jìn)行培養富集，這對其他人體部位菌群同樣適用，如腸道中有很多微生物在人群中普遍存在，而有些微生物則對某些個(gè)體來(lái)講是特異的。我們不能預先知道哪些樣品可以體現菌群狀態(tài)，但我們可以采用16S rRNA測序，以確定菌群物種分布，來(lái)選擇哪些樣品適合進(jìn)行富集培養。
作者采用了PLCA算法，來(lái)決定需要進(jìn)行富集培養宏基因組測序的最小樣品數，算法對任何含有大部分可培養富集的菌群生態(tài)均適用。PLCA算法有兩個(gè)版本，從頭 PLCA不依賴(lài)于直接測序結果再現富集培養菌群，而校正PLCA側重于直接測序結果中OTU的修復，這取決于是否都對原始樣品的菌群組成感興趣。采用這兩種算法，數據集凸顯了不同樣本的獨特性：從頭PLCA顯示，每個(gè)樣本具有獨特的平板集，并且每個(gè)培養條件對每個(gè)樣本都是必要的；校正PLCA顯示對數據集中樣本進(jìn)行富集培養宏基因組測序是很有必要的（圖4a,b）。
圖4 PLCA算法確定了富集培養宏基因組測序的最佳平板組
富集培養宏基因組測序提供了更好的分類(lèi)和功能分辨率
作者選擇代表性樣品，同時(shí)采用PLCA算法的兩個(gè)版本。從頭PLCA和校正PLCA分別顯示需要進(jìn)行5個(gè)和3個(gè)富集培養平板的宏基因組測序。通過(guò)宏基因組樣本合并組裝、binning和物種注釋?zhuān)容^兩種算法的實(shí)驗結果和預期結果。從頭PLCA恢復10個(gè)bins，與PLCA閾值上的10個(gè)OTUs物種比對結果一致，另有6個(gè)閾值以下的物種，校正PLCA恢復了預期10個(gè)預期的OTUs，另有14個(gè)閾值下的OTUs（圖4c）。
對從頭PLCA、校正PLCA和直接宏基因組測序的數據集分別進(jìn)行合并組裝、binning，定義完整度≥70%和污染度＜10%的為MAG，閾值下為non-MAG。其中從頭校正PLCA得到7MAGs和9個(gè)non-MAG bins，校正PLCA得到12個(gè)MAGs和12個(gè)non-MAG bins，而直接宏基因組測序僅得到1個(gè)MAG和1個(gè)non-MAG bin（圖5）。直接測序的序列比對富集培養的bins，在從頭PLCA和校正PLCA中均只在1個(gè)bin中觀(guān)察到顯著(zhù)覆蓋（圖5,藍點(diǎn)）。直接測序獲得2個(gè)bins均注釋到假單胞菌的種，富集培養的bins注釋物種多樣性增加（14個(gè)屬，圖5）
通過(guò)富集培養獲得的分類(lèi)學(xué)多樣性的增加直接轉化為該微生物群落功能信息的增加（圖6）。富集培養測序在直系同源蛋白簇（COGs）、毒力基因、抗生素抗性基因、CRISPRs和次級代謝功能方面獲得更大的多樣性和功能鑒定數量。先前的研究已經(jīng)證實(shí)囊性纖維化氣道以及整個(gè)人類(lèi)微生物群中存在單一物種的異質(zhì)性群體。作者通過(guò)鑒定基因單倍型來(lái)計算每個(gè)宏基因組bin的遺傳變異性（圖6d）。在一些宏基因組bins中，作者鑒定到一個(gè)一致的和少量的基因單倍型，表示這個(gè)bin代表一個(gè)單一的基因組群體（即一個(gè)菌株）。在大多數bins中，作者觀(guān)察到大量的單倍型多樣性，指示異質(zhì)性群體，即多菌株。不出所料，這些區域中每個(gè)基因的單倍型數量是多種多樣的，這表明細菌基因組內進(jìn)化壓力的已知范圍。平均而言，假單胞菌屬種中鑒定出更多的基因單倍型，富集培養的bins比直接測序更多。然而，直接測序鑒定了大量的普遍存在的單倍型基因離群值。Bin的完整性與平均單倍型頻率沒(méi)有相關(guān)性。
圖5 項目數據中第一批樣本直接測序和腹肌培養測序的MAG和non-MAG bins結果
圖6 直接和富集培養宏基因組測序的物種和功能多樣性結果
討論
測序成本的降低和測序技術(shù)的增加，徹底改變了我們研究人類(lèi)微生物群的方式，從而使人們對群落及其與健康和疾病之間的關(guān)系有了更深入的了解。腸道是目前研究最深入的人體微生物組，很多研究將其與各種疾病和狀況聯(lián)系在一起。皮膚、活檢組織、口腔微生物樣本等許多重要的與人類(lèi)相關(guān)的群落具有高比例的非微生物DNA，這些樣本的宏基因組測序數據由于宿主污染，必須通過(guò)比對過(guò)濾掉大部分序列，意味著(zhù)只有群落中高豐度比例的物種可以被組裝成MAGs。作者論證了與傳統培養技術(shù)相關(guān)聯(lián)的富集宏基因組測序可以提高群落的分辨率，并且為了最有效的結合富集培養和直接測序，作者設計了PLCA算法，其確定了對于重現原始菌群（擴增子測序），富集培養宏基因組測序很有必要。
富集培養測序與直接測序相結合觀(guān)察到更多的物種多樣性并且更深入的了解與人類(lèi)相關(guān)的微生物群落，更好的了解每種微生物的基因組成。此外，將這些微生物進(jìn)行培養，我們可以進(jìn)行體外機制的研究，并且可以在人類(lèi)健康和疾病的背景下，更好的了解這些群落。
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