【項目案例】群體研究——BSA、遺傳圖譜應用案例

利用基因組重測序技術(shù)進(jìn)行大規模高通量SNP標記鑒定是當前國際上動(dòng)植物基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)。利用得到的大量SNP標記，可以對群體進(jìn)行高密度遺傳圖譜、BSA、GWAS、遺傳進(jìn)化等分析。百邁客在群體研究領(lǐng)域又有哪些應用呢？下面和小編一起學(xué)習一下遺傳圖譜和BSA的項目案例。

遺傳圖譜

遺傳圖譜（Genetic map），是基于全基因組重測序技術(shù)或簡(jiǎn)化基因組測序技術(shù)，對某物種家系樣本進(jìn)行測序，利用生物信息學(xué)方法，開(kāi)發(fā)SNP分子標記，計算標記間的遺傳連鎖距離，繪制高密度遺傳圖譜。利用遺傳圖譜，主要可以進(jìn)行QTL定位，比較基因組，輔助基因組組裝等科研工作。本研究報道了利用百邁客SLAF測序技術(shù)，對菊花F1群體測序并構建高密度遺傳圖譜，用于菊花花型等性狀的QTL定位及候選基因鑒定的研究。

菊花 (Chrysanthemum×morifolium Ramat.) 作為重要的觀(guān)賞性植物，花型對于它至關(guān)重要。舌狀花花冠筒基部合生程度（CTMD）和舌狀花相對數量（RNRF）是影響花型的兩個(gè)關(guān)鍵性狀，但由于這兩個(gè)性狀構成要素相對復雜，其遺傳機制還未被揭示，進(jìn)而限制了菊花花型改良的定向育種。
本研究對CTMD和RNRF差異較大的菊花‘Candy’和菊花‘225’親本以及305個(gè)F1代雜交群體進(jìn)行了SLAF-seq簡(jiǎn)化基因組測序，測序深度分別為57.48X，59.69X和23.52X，通過(guò)分析鑒定得到了234,648個(gè)高質(zhì)量SNPs，利用高質(zhì)量的SNPs構建了一套總圖距為4301.5cM、平均圖距為0.76cM的菊花高密度遺傳圖譜，為菊花花型遺傳育種研究提供了豐富的遺傳標記。

圖1 雙親的花型表現

圖2 菊花高密度遺傳圖譜

基于這一圖譜，結合連續兩年的表型數據，對9個(gè)菊花花型性狀進(jìn)行了QTL分析，定位到123個(gè)相關(guān)QTLs位點(diǎn)；控制CTMD的QTLs有16個(gè)（圖3），其中有3個(gè)為主效QTLs，LOD值分別為3.77，5.09和5.23（圖4）；控制RNRF的QTLs有34個(gè)（圖5），其中有4個(gè)為主效QTLs。LOD值分別為4.11，4.74，4.96和5.22（圖6）。

圖3 CTMD性狀的QTL定位結果

圖4 CTMD性狀的主效QTL定位結果

圖5 RNRF性狀的QTL定位結果

圖6 RNRF性狀的主效QTL定位結果

為了進(jìn)一步發(fā)掘潛在的候選基因，將菊花遺傳圖譜與已發(fā)表的近緣物種向日葵和生菜的基因組進(jìn)行共線(xiàn)性分析，結果發(fā)現菊花遺傳圖譜上有150個(gè)SNPs標記可以比對到向日葵基因組，0.12%的SNPs標記可以比對到生菜基因組；依據基因組注釋信息，檢測得到向日葵基因組中有8個(gè)候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)，生菜基因組中有20個(gè)候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)。利用同樣的方法，對甘野菊（C. seticuspe）的參考基因組和兩個(gè)野生菊花，毛華菊（C. vestitum）和甘菊（C. lavandulifolium） 的轉錄組數據做了分析，得到了一些與CTMD和RNRF性狀相關(guān)的候選基因。
本研究通過(guò)構建菊花高密度遺傳圖譜，為菊花高密度遺傳定位和與花型性狀相關(guān)的QTL鑒定提供了有用的基準信息，為進(jìn)一步闡明菊花花型遺傳機理提供了新見(jiàn)解，同時(shí)也有利于加速菊花花型的定向改良育種。

Bulked Segregant Analysis (BSA)

BSA（Bulk Segregant Analysis）分析是利用極端性狀個(gè)體混池快速進(jìn)行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應用在植物基因克隆方面。利用該方法，可以快速的對單一性狀進(jìn)行精細定位，加速目標性狀的功能基因組研究進(jìn)程。本研究利用百邁客SLAF-BSA-seq技術(shù)，結合親本重測序，對番茄柱頭外露基因進(jìn)行基因定位，并對定位基因進(jìn)行功能驗證。

番茄（Solanum lycopersicum）作為自花授粉作物，有著(zhù)超然的雜種優(yōu)勢，其雜交品種產(chǎn)量高，抗性好，因此番茄在生產(chǎn)上多采用雜交種。目前，在研究番茄雜交育種過(guò)程中，利用雄性不育系協(xié)助雜交種子的生產(chǎn)成為了新趨勢。本研究主要從形態(tài)、生理及基因定位三個(gè)方面進(jìn)行研究。
本研究利用石蠟切片法對其結構變化及不育原因進(jìn)行觀(guān)察，觀(guān)察不育材料T431（圖1E）與對照材料（圖1B）成熟花柱的橫切，可以看出不育材料T431花柱中的維管束數目多于對照材料。同時(shí)形態(tài)觀(guān)察時(shí)發(fā)現不育材料花柱直徑顯著(zhù)大于對照材料，維管束數目的增多可能直接導致了不育材料花柱直徑變大（圖1C, D, F, G）。觀(guān)察成熟花柱的細胞發(fā)現不育材料與對照材料花柱細胞大小沒(méi)有顯著(zhù)差別。因此說(shuō)明不育材料花柱伸長(cháng)是由花柱細胞數目增多導致而非細胞體積變大導致。

圖1 花柱解剖結構圖

采用高效液相色譜法對花柱中不同時(shí)期的五種激素含量的變化進(jìn)行了分析，從整體含量變化來(lái)看，不育材料T431中IAA的增長(cháng)率達到了176.6%，而對照材料中IAA的增長(cháng)率僅為25.6%，說(shuō)明不育品種中花柱維管束數目增多可能是由于IAA水平的升高導致（圖2 A）；GA3含量整體變化趨勢一致，GA3含量在不育材料T431中均高于對照材料（圖2B）；在花發(fā)育前期可育材料中ZT含量高于不育材料T431，后期出現波動(dòng)（圖2C）；ABA含量在對照材料中從整體上來(lái)看呈穩步上升趨勢，而不育材料T431中則較為平穩，并沒(méi)有明顯的變化（圖2D）；不育材料T431中SA含量在花不同發(fā)育時(shí)期的變化趨勢與對照材料呈現相反的趨勢（圖2E）。結果表明不育材料T431中GA3水平的提升，IAA和ZT含量的積累，ABA與水楊酸的不同變化趨勢以及這5種激素間的相互作用均對花柱的伸長(cháng)產(chǎn)生了影響，導致不育的發(fā)生。

圖2 T431（不育材料）和DL5（對照材料）中不同激素在不同時(shí)期的變化趨勢
1-4分別表不花蕾長(cháng)度0.5 cm．0.7 cm，0.9 cm，1.1 cm；5-8分別表示花瓣開(kāi)張角30°，45°，60°，90°。

作者利用親本重測序技術(shù)與Super-SLAF-BSA-seq的方法相結合來(lái)對番茄部位不育基因進(jìn)行定位。以番茄位置不育型雄性不育材料T431為父本，可育材料DL5為母本進(jìn)行雜交，得到F1代，再將F1代自交獲得F2代分離群體，在F2代中選取50株不育株和50株可育株，構建可育池和不可育池，提取父本和母本的DNA，構建父本池和母本池，最終得到4個(gè)混池；分析發(fā)現兩個(gè)子代混池樣本間共有154,756個(gè)SLAF標簽，使用BWA軟件將SLAF標簽定位到番茄基因組上，對不同染色體上的SLAF標簽和多態(tài)性SLAF標簽的數目進(jìn)行匯總（圖3）,通過(guò)SNP的檢測和過(guò)濾，最終得到9,411個(gè)高質(zhì)量的可信SNP位點(diǎn)。

圖3 SLAF標簽分布圖（A）和多態(tài)性SLAF標簽分布圖（B）

接著(zhù)利用混池間差異SNP的深度差異，使用ED算法來(lái)分析計算與目的基因相連鎖的區域，結果顯示12號染色體上存在兩個(gè)較大且較明顯的區域，這兩個(gè)區域的大小分別為1.75 Mbp和3.15 Mbp，作者最終確定這兩個(gè)區域與目標基因相連鎖，并將其選為候選區域（圖4）；利用百邁客云平臺分析，在番茄12號染色體上的兩個(gè)候選區域內共找到26個(gè)候選基因，通過(guò)GO、KEGG數據庫比對分析，最終將Solyc12g027610.1確定為本研究的候選基因；對該基因功能進(jìn)行分析發(fā)現，Solyc12g027610.1參與了細胞分裂素的代謝過(guò)程，且與多種激素的信號轉導途徑有關(guān)。另外，Solyc12g027610.1作為一個(gè)乙烯受體蛋白，與番茄乙烯受體基因SlETR以及擬南芥中編碼蛋白AtEIN4的乙烯基因高度同源。

圖4 兩個(gè)混池的BSA分析結果

最后，作者對番茄SILst基因進(jìn)行基因功能驗證及亞細胞定位；亞細胞定位結果顯示，基因SlLst于細胞核和細胞膜中均有分布；通過(guò)對基因SlLst過(guò)表達番茄的表型分析進(jìn)行基因功能驗證，表明基因SlLst在柱頭外露過(guò)程中起重要作用。
本研究分析了番茄外露柱頭的形態(tài)變化和激素作用，結合親本重測序和SLAF-BSA-seq，快速定位到番茄外露柱頭候選基因SlLst，并對基因SlLst進(jìn)行了功能分析，為基因克隆及分子標記輔助育種提供一條強有力的途徑。

好消息

目前百邁客云平臺已經(jīng)把全基因組重測序分析、BSA分析、GWAS、遺傳進(jìn)化分析四種測序分析技術(shù)實(shí)現了云交付。百邁客云分析平臺整合了目前最主流的分析流程，結果準確有保證，分析過(guò)程簡(jiǎn)單易上手，從數據上傳到參數設置，再到基因組選擇，只需簡(jiǎn)單幾步就可以完成項目數據的投遞和分析；結題報告云交付，分析完成即可拿到項目結果。詳情咨詢(xún)當地銷(xiāo)售！

參考文獻

[1] Song XB, Xu YH, Gao K, et al. High-density genetic map construction and identification of loci controlling flower-type traits in Chrysanthemum (Chrysanthemum × morifoliumRamat.). Hortic Res, 2020.07

[2] Cheng MZ, Gong C, Zhang B, et al. Morphological and anatomical characteristics of exserted stigma sterility and the location and function of SlLst (Solanum lycopersicum Long styles) gene in tomato. Theor Appl Genet. 2020.11