【文獻精讀】甲基化和轉錄組能擦出怎樣的火花

每個(gè)人的衣櫥的里面都會(huì )有一件白色的T恤，因為百搭。其實(shí)測序界也有一件白色的T恤，小伙伴們你們猜出來(lái)了嗎？沒(méi)錯，它就是轉錄組。轉錄組是一款比較基礎的測序產(chǎn)品，他可以和不同的組學(xué)進(jìn)行搭配，或是用于找關(guān)鍵的biomarker，或是用于協(xié)助解析分子機制。

今天小編就帶著(zhù)大家看一篇關(guān)于的轉錄組、RNA甲基化、蛋白組聯(lián)合的文章。這篇文章中RNA甲基化是采用的MeRIP-seq二代的技術(shù)，操作相對比較復雜，現在已經(jīng)可以升級做ONT RNA甲基化，值得一提的是這篇文章的整體思路是可以借鑒的。

 

文章思路快速get ：

文章中通過(guò)RNA甲基化試劑盒的檢測發(fā)現在黑素瘤樣本中m6A甲基化水平降低，為了進(jìn)一步研究m6A甲基化在腫瘤樣本中的調控機制。采用RNA-seq、MeRIP-seq等技術(shù)找到關(guān)鍵的基因HINT2，隨后在細胞系中進(jìn)行敲除實(shí)驗，檢測細胞侵襲、凋亡等情況；同時(shí)進(jìn)行RIP-qPCR、RNA-pull down以及雙熒光素酶實(shí)驗等實(shí)驗，揭示了m6A甲基化修飾在眼部黑色素瘤腫瘤中調控中的機制，為后續研究以及藥物治療提供了新的見(jiàn)解。? ??

 

研究背景

惡性黑素瘤( malignant melanoma，MM) 的發(fā)生率在常見(jiàn)腫瘤中排第 4 位，分別占男性和女性癌癥病例的 6.4%和 4.1%。約 91%的 MM 發(fā)生在皮膚上，皮膚黑素瘤( cutaneous malignant melanoma，CMM) 是最具攻擊性和致命性的皮膚腫瘤。ＲNA 甲基化是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，目前發(fā)現其參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，與免疫治療耐受的發(fā)生密切相關(guān)，其在黑素瘤中的研究也逐漸引起關(guān)注。

 

技術(shù)平臺

RNA-seq、MeRIP-seq、Label-free MS

 

研究結果

1.?黑素瘤樣本中m6A甲基化水平降低

Fig1 m6A水平降低與眼部黑色素瘤預后不良有關(guān)

為了研究m6A甲基化在眼惡性黑色素瘤中的功能作用，研究者用甲基化試劑盒先對腫瘤樣本和正常樣本做甲基化整體水平檢測，發(fā)現在腫瘤樣本中RNA甲基化的水平明顯降低（Fig. 1a）。同時(shí)通過(guò)免疫熒光實(shí)驗和含量檢測，發(fā)現甲基化轉移酶METTL3相對于正常的樣本來(lái)說(shuō)，有明顯的降低；而去甲基化酶（eraser）ALKBH5在則明顯高于正常組織樣本（Fig. 1b-1c）。Kaplan-Meier分析顯示METTL3低表達會(huì )增強腫瘤早期復發(fā)和細胞侵襲，而高表達ALKBH5則顯示預后不良。除此之外，黑色素瘤腫瘤細胞系結果也與組織樣本中的結果一致。這些數據表明，不管是組織樣本還是細胞系樣本中，黑色瘤素樣本中可以通過(guò)低表達METTL3或者高表達ALKBH5來(lái)降低m6A修飾。

為了進(jìn)一步說(shuō)明上述結論的準確性，研究者在細胞系做分別對METTL3、ALKBH5進(jìn)行敲除實(shí)驗。發(fā)現沉默METTL3后，正常黑素細胞形成較大的集落，細胞分裂加快，凋亡減少；沉默ALKBH5，m6A甲基化顯著(zhù)增加，細胞分裂減少，凋亡增加。同時(shí)轉錄組RNAseq和GSEA分析都進(jìn)一步證明在高m6A修飾的細胞系中抗腫瘤明顯，并且ALKBH5是主要靶基因簇。

2.?甲基化測序和轉錄組測序尋找m6A介導的潛在靶點(diǎn)

隨后對正常細胞系和腫瘤細胞系進(jìn)行MeRIP-seq和miCLIP-seq進(jìn)行甲基化檢測。從正常細胞和腫瘤細胞生成的miclipo -seq文庫中，平均鑒定出13,083和11,750個(gè)m6A峰。實(shí)驗結果表明，m6A修飾在腫瘤細胞中廣泛重復，而正常細胞中有更多的基因只有一個(gè)m6A位點(diǎn)。同時(shí)鑒定到有5828個(gè)m6A顯著(zhù)改變的基因。GO 注釋結果顯示這些基因主要富集在細胞增殖和細胞死亡。KEGG通路分析顯示在HIF-1 和 p53通路有明顯富集。并且正常細胞中含有m6A修飾的轉錄本數量比腫瘤細胞高出5倍以上(Fig2a)，而這些轉錄本主要參與細胞增殖和腫瘤發(fā)生相關(guān)的幾種信號通路(Fig2b)。這些現象都表明m6A在腫瘤發(fā)生過(guò)程中有著(zhù)重要的調控作用。

為了系統地闡明眼黑色素瘤中m6A修飾減少導致的基因表達變化，研究者結合轉錄組、蛋白定量的數據找到了237個(gè)相關(guān)的基因(Fig2c)。正如預期的那樣，這些基因存在m6A修飾，且基因mRNA表達和蛋白表達不一致，說(shuō)明m6A修飾可能影響轉錄后調控。找到的這些基因主要還是集中細胞周期、細胞粘附和蛋白過(guò)程(Fig2d)。其中HINT2是在正常細胞中蛋白表達和m6A富集最顯著(zhù)的基因之一，因此研究這選擇它作為典型例子來(lái)分析m6A修飾在腫瘤發(fā)生過(guò)程中作為翻譯調節因子的機制(Fig2e)。在miCLIP-seq數據中，發(fā)現3’UTR上的HINT2 mRNA中有一個(gè)具有統計學(xué)意義的m6A峰，在正常細胞中富集明顯(Fig2f)。為了驗證該結論的準確性，作者通過(guò)RIP-qPCR、Western blotting和qPCR驗證了HINT2 mRNA上m6A修飾減少，HINT2蛋白表達下調，而mRNA水平無(wú)顯著(zhù)變化。

 

 

Fig2 轉錄組范圍內識別調控腫瘤發(fā)生的m6A靶點(diǎn)

 

3.?HINT2依賴(lài)于m6A抑制眼部黑色素瘤

在眼黑色素瘤細胞中，在mRNA水平和蛋白水平均過(guò)表達HINT2。發(fā)現過(guò)表達HINT2后，眼黑色素瘤細胞的細胞增殖、細胞遷移、和克隆形成明顯受到抑制，細胞凋亡增加。此外，GSEA顯示在腫瘤細胞中HINT2促進(jìn)凋亡和細胞死亡(Fig3a)。為了確定HINT2在體內腫瘤特征中的作用，過(guò)表達HINT2的眼黑色素瘤細胞進(jìn)行了皮下移植。結果顯示：相對于對照組(Fig3b, A組)來(lái)說(shuō)，實(shí)驗組HINT2過(guò)表達組(Fig3b, B組)腫瘤體積持續降低。為了研究這些蛋白表達的變化是否在樣本中發(fā)生，在眼黑色素瘤和正常組織中進(jìn)行IF實(shí)驗(Fig3c)，發(fā)現HINT2確實(shí)在腫瘤樣本中下調。除此之外，在眼黑色素瘤組織樣本中，低表達的HINT2與不良預后高度相關(guān)(Fig3e)。

由于HINT2在眼黑色素瘤中抑制細胞生長(cháng)和遷移，并且與正常細胞相比，腫瘤中m6A甲基化減少，推測m6A修飾降低會(huì )上調HINT2表達從而抑制腫瘤生長(cháng)。通過(guò)對的MeRIP的RNA片段進(jìn)一步檢測發(fā)現HINT2 mRNA的 3’UTR上m6A峰被METTL3特異性甲基化，和ALKBH5去甲基化。除此之外，HINT2蛋白的表達水平遠遠高于mRNA的表達水平。隨后在腫瘤細胞系構建敲除HINT2細胞系，結果都表明m6A引導的腫瘤抑制作用部分來(lái)源于HINT2的轉錄后調控。

 

Fig3?HINT2在眼黑色素瘤細胞中起抑癌基因的作用

 

4.?m6A修飾促進(jìn)了HINT2翻譯

??????????因為m6A甲基化似乎促進(jìn)了HINT2的翻譯，作者假設HINT2轉錄本是YTH家族的靶點(diǎn)，YTH家族是m6A解讀器，調控m6A修飾的轉錄本的翻譯。RIP-qPCR分析顯示，HINT2 mRNA與YTHDF1的相互作用強于其他 mRNA(Fig4a)。此外，RNA-pull down實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)YTHDF1與HINT2 mRNA相互作用，HINT2的m6A修飾極大地促進(jìn)了其與YTHDF1的結合(Fig4b, c)。YTHDF1表達下調(Fig4d line 1)降低了HINT2 蛋白的表達(Fig4d line2)，而YTHDF1過(guò)表達(Fig4e, f line 1)增加了HINT2蛋白的表達(Fig4e- f line2)。這些HINT2表達的變化不是由于HINT2 轉錄本豐度的變化(Fig4d-f)；而是mRNA翻譯的調控依賴(lài)于轉錄本的甲基化。同時(shí)HINT2 3’UTR (WT)或m6A位點(diǎn)突變(MT)序列構建雙熒光素酶載體，雙熒光素酶實(shí)驗也顯示，ALKBH5顯著(zhù)降低了報告基因的熒光素酶活性，(Fig4g)。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)m6A修飾，HINT2轉錄本與積極轉錄核糖體的關(guān)聯(lián)得到了改善(Fig4h)。綜上所述，當YTHDF1識別HINT2時(shí)，m6A修飾對其翻譯有影響。

 

Fig3 YTHDF1 促進(jìn) HINT2翻譯

 

? 5.?總結

總的來(lái)說(shuō)，m6A修飾在眼黑色素瘤腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用。在眼黑色素瘤樣本中m6A水平降低，提示預后不良，且整體m6A修飾的改變與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。機制上，YTHDF1促進(jìn)了眼部黑色素瘤腫瘤抑制因子HINT2 mRNA甲基化修飾，影響轉錄后翻譯。本研究揭示了m6A甲基化修飾在眼部黑色素瘤腫瘤中功能，為后續機制研究以及藥物治療提供了新的見(jiàn)解。