茄子(Solanum melongena L. ; 2n = 24)生長(cháng)并馴化于印度與東南亞地區，是一種比較重要的經(jīng)濟類(lèi)茄科作物；然而與番茄、辣椒和馬鈴薯等茄科作物相比，茄子高密度遺傳圖譜構建與基因圖位克隆比較滯后。本研究報道了浙江省農科院蔬菜所魏慶鎮博士利用百邁客SLAF測序技術(shù)，對茄子種間分離F2群體測序并構建高密度遺傳圖譜，用于果實(shí)大小、葉片形態(tài)、花青素含量等相關(guān)性狀的QTL定位分析研究。測序共獲得111.74 Gb數據與487.53M 的雙端測序reads，構建出的遺傳圖譜包含2122個(gè)SNP標記與12條連鎖群，遺傳總圖距為1530.75cM，平均圖距為0.72cM。QTL定位共檢測到19個(gè)QTL位點(diǎn)，可解釋4.08~55.23%的表型變異，這些QTLs分布在除LG2、4、9外的其它9個(gè)連鎖群上。其中，每個(gè)QTL中包含2到11個(gè)SNPs，遺傳間距變化范圍為0.15cM~10.53cM。本研究結果為復雜QTLs的精細定位、候選基因挖掘以及茄子育種中分子標記輔助選擇奠定了較好的研究基礎。
1. 群體構建：野生近緣種“1809”（Solanum linnaeanum♀，帶刺、小/圓/綠條紋果）×栽培種“1836”（S. melongena♂，長(cháng)/紫色果實(shí)、少刺）→ F1 → F2（種間，121個(gè)子代）
2. 性狀調查：主莖高度（MSH），果實(shí)長(cháng)度（FL），果實(shí)直徑（FD），果形指數（FL/FD；FS），葉片裂刻（LLOB），葉刺數目（LPN），葉刺顏色（LPC），葉脈顏色（VC）
3. 測序技術(shù)：SLAF-seq
4. 圖譜構建：HighMap、SMOOTH algorithm、 Joinmap、 k-nearest neighbor algorithm、regression algorithm、Kosambi mapping
5. QTL定位：R/QTL軟件、復合區間作圖法 (CIM)
圖1. Fruit and leaf morphology of the two eggplant parental lines and the F2 population. (a) Leaves of Solanum linnaeanum “1809” (right) and S. melongena “1836” (left); (b) mature fruits of “1809” (right) and “1836” (left); (c) mature fruits of the representative F2 individuals; (d) leaves of the representative F2 individuals.
SLAF測序與SNP標記基因分型
對雙親+121個(gè)F2子代進(jìn)行SLAF建庫測序，共獲得111.74 GB的數據量，包含487.53 M PE reads，其中 94.04%的reads質(zhì)量值達到或超過(guò)Q30，GC含量為38.83%。親本及子代的平均測序深度分別為19.48×（母本），19.46×（父本），10.29×（F2子代）?？偣查_(kāi)發(fā)出13,455,526 SNP標記，而11,386,169個(gè)SNP被成功分成8種基因型（ab × cd, ef × eg, hk × hk, lm × ll, nn × np, aa × bb, ab × cc, cc × ab）， 其中，9,971,182個(gè)SNP（占比74.10%）的基因型為aa × bb，用于后續進(jìn)一步分析。
偏分離分析
根據親本測序深度，覆蓋度與偏分離P值三個(gè)參數，計算了七個(gè)參數組合下的偏分離結果，剩余標記數目介于10,773到64,320之間。在同一測序深度與覆蓋度下，隨著(zhù)P值減小，標記數目呈現增加的趨勢。偏分離標記過(guò)濾后，不管P值如何改變，LG2，LG5，LG10與LG12有相對少的標記數量，其中LG2有最少的SNPs（26~46個(gè)），而LG5的數目變化最大（80-588個(gè)），P值< 0.05時(shí)，僅有80個(gè)SNPs，P值< 0.001時(shí)，有577個(gè)SNPs，因此，LG5上大部分標記屬于偏分離標記。相似的結果在LG10與LG12上也被發(fā)現。降低測序深度、覆蓋度與P值后，這四個(gè)連鎖群上的標記數目有略微增加。然而，如果不經(jīng)偏分離標記篩選，這四個(gè)連鎖群標記數目將有顯著(zhù)提高?；谶@些結果，我們采取兩種方法過(guò)濾偏分離標記，確保標記的數量與質(zhì)量。
遺傳連鎖圖譜構建
標記過(guò)濾與質(zhì)量評估后，共2122個(gè)SNP標記可用于遺傳圖譜構建，且母本、父本以及子代群體的SNP平均測序深度分別為15.03×，14.09×與24.68×。利用JoinMap 5.0 構建出一張茄子的高密度遺傳圖譜，遺傳距離總長(cháng)度為1530.75 cM，平均圖距為0.72 cM。每個(gè)LG上的SNP數目為90個(gè)(LG2)到273個(gè) (LG9)，遺傳距離為38.67 cM (LG2)到165.29 cM (LG1)，平均標記間距為0.43到1.4 cM。其中，最長(cháng)的連鎖群是LG1，包含167個(gè)SNPs，然而最短的連鎖群是LG2，包含90個(gè)SNPs。
表型評估
從圖1.可以看出茄子親本及F2群體的的表型特征，本研究統計分析了8個(gè)性狀：主莖高度（MSH）、果實(shí)長(cháng)度（FL）、果實(shí)直徑（FD）、果形指數（FS）、葉片裂刻（LLOB）、葉刺數目（LPN）、葉刺顏色（LPC）以及葉脈顏色（VC）。MSH, FL, FD,與FS用尺子或游標卡尺測量；LLOB與LPN通過(guò)分級（1-7）的方式統計；LPC從淡綠色到深紫色變化，根據顏色深度，用1~4區分顏色；VC用1-~3量化顏色。性狀相關(guān)系數結果顯示，LPC與VC具有比較高的相關(guān)性，而FL與FD、FS更為相關(guān)。此外，LLOB與LPN也有明顯的相關(guān)性（相關(guān)系數為0.65）。高度相關(guān)的性狀可能擁有某些緊密連鎖的標記或候選基因，例如，葉刺與莖刺、果實(shí)長(cháng)度、果實(shí)橫徑與果形指數以及葉脈顏色與葉刺顏色。實(shí)際上，花青素積累相關(guān)的基因可同時(shí)影響葉脈、莖、葉刺和果皮的顏色，這在候選基因預測以及功能分析中非常有用。果實(shí)的大小形狀由果實(shí)的長(cháng)度與橫徑?jīng)Q定，因此，茄子果實(shí)形狀的育種對這兩個(gè)方面都要考慮。
FIGURE 2 | SNP-based genetic linkage map of the interspecific F2 population showing positions of QTLs. The numbers to the right of each LG indicate genetic distance (cM) between adjacent markers. The color bars refer to QTLs detected for the eight traits.
茄子形態(tài)性狀的QTL定位
本研究QTL定位結果顯示，共有19個(gè)QTLs與上述8個(gè)性狀（MSH、FL、FD、FS、LLOB、LPN、LPC、VC）有關(guān)。它們能夠解釋的表型變異（PVE）為4.08-55.23%，LOD變異范圍為2.09-28.75，且每個(gè)QTL區間內的SNP數目為2-11個(gè)，遺傳距離變化范圍為0.15-10.53 cM。通過(guò)將標記序列BLAST到茄子的參考基因組上得到QTLs的物理位置，分布在9條染色體或連鎖群（包括LG1, 3, 5, 6,7, 8, 10, 11,與12），從上表中即可看出QTL位置與標記信息。
MSH定位到1個(gè)QTL，即msh5.1，可解釋6.8%的表型變異，且包含11個(gè)SNPs。盡管msh5.1在遺傳圖上是一個(gè)連續的區間，然而，對應到物理圖譜上包含兩個(gè)區間，即Chr.5: 5.98-7.93 Mb與13.57-19.22 Mb。
FL定位到4個(gè)QTL，即fl1.1, fl5.1, fl7.1, 與fl12.1，分別位于LG1,5,7,12上。最主效的QTL為fl12.1，可解釋24.05% 的表型變異，其次為fl1.1與fl5.1（PVE為12.00與13.06%），貢獻率最低的為fl7.1（PVE僅為4.08%），此外，在fl5.1中鑒定到11個(gè)SNPs。這4個(gè)QTLs中，除fl12.1的標記Marker8964317遠離其它兩個(gè)相鄰的標記外，其它QTL標記均處于合理的距離。
FD定位到4個(gè)QTL，分別位于LG3與11上，QTL貢獻率分別為fd3.1（11.98%）、fd3.2 (8.50%)、fd11.1 (7.95%)與fd11.2 (6.62%)。每個(gè)QTL的遺傳距離為0.15-0.68 cM.；fl12.1與fd3.2存在部分重疊，fd11.1與fd11.2分別跨越Chr11：71.47-71.87 cM and 82.29-82.98 cM。并且每個(gè)QTL包含的SNP數目為2-4個(gè)。
FS同樣檢測到4個(gè)QTLs，貢獻率為6.92% (fs1.1)-10.92% (fs3.1)，其中在LG1上包含3個(gè)QTLs（fs1.1, fs1.2, fs1.3），并且遺傳位置比較接近。fs1.3 (111.30-111.91 Mb) 的物理位置位于fs1.1 (110.94-124.29 Mb)區間內，另外一個(gè)QTL定位在LG3上，它的位置比較接近fd3.1。
LLOB由2個(gè)QTLs，即llob6.1與llob7.1調控，PVE分別為55.23%（LOD：8.99）與9.68%（LOD：2.63）。
對于LPN，2個(gè)QTL，即lpn7.1與lpn8.1，被定位到，可貢獻9.69與7.39%的表型變異。lpn7.1的物理區間為17.29-33.55 Mb。
LPC檢測到一個(gè)主效的QTL (lpc10.1) ，解釋36.95%的表型變異，LOD值為27.65；而VC的QTL為lvc10.1，其與lpc10.1存在物理位置的重疊，可解釋52.10%的表型變異。
FIGURE 3 | Graphic view of the distribution of markers associated with related traits on eggplant chromosomes.
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