ONT甲基化測序研究重磅來(lái)襲??！

DNA甲基化是表觀(guān)遺傳的經(jīng)典修飾方式，其并不改變基因的堿基序列，而是通過(guò)改變基因的表達影響細胞的功能，在調控基因表達、維持染色質(zhì)結構、基因印記、X染色體失活以及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重大的作用。DNA 甲基化的形式多種多樣，主要包括 C5-甲基胞嘧啶（5mC）、N6-甲基腺嘌呤（6mA）等。

目前市場(chǎng)常用重亞硫酸鹽法檢測5mC，其√確度高，但化學(xué)處理會(huì )導致DNA分子的片段化、測序深度高、無(wú)法鑒定更多修飾類(lèi)型。Nanopore技術(shù)作為新一代基于納米孔的單分子實(shí)時(shí)電信號測序技術(shù)，截至目前，全球范圍內基于Nanopore平臺進(jìn)行的甲基化研究文章近10篇，見(jiàn)刊于nature methods、bioRxiv等國際知名期刊。

ONT甲基化測序流程

不同于傳統的甲基化檢測方法，使用ONT平臺進(jìn)行測序前，不需要再對DNA樣本進(jìn)行化學(xué)處理，避免了人為因素和化學(xué)因素的影響。具體步驟如下：

1、提取高質(zhì)量基因組 DNA，利用Nanodrop、Qubit 和35% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度、濃度和完整性質(zhì)檢；

2、將基因組DNA打斷成平均8kb左右；

3、使用SQK-LSK109連接試劑盒（ONT官方試劑）進(jìn)行文庫構建，包括DNA 損傷修復和末端修復、接頭連接、磁珠純化等；

4、使用Qubit 進(jìn)行文庫定量。

? ? ? ? 圖1 甲基化建庫流程? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2 ONT 電信號識別

待文庫構建完成后，就可進(jìn)行上機測序。 ONT 測序是新一代基于納米孔的單分子實(shí)時(shí)電信號測序技術(shù)，由于 DNA 鏈上不同堿基化學(xué)性質(zhì)存在差異，所以當單個(gè)堿基通過(guò)納米孔通道時(shí)，會(huì )產(chǎn)生不同的電信號，而當存在堿基修飾時(shí)，同一位置的電信號也會(huì )有所差別?；诖?，軟件則將這些電信號進(jìn)行識別，判讀為不同的修飾信息。

ONT甲基化的優(yōu)勢?

?單堿基水平檢測，無(wú)中間處理，不擴增、不富集，真實(shí)還原堿基修飾信息

?測序讀長(cháng)長(cháng)，避免短讀長(cháng)帶來(lái)的拼接比對錯誤，鑒定z確

?鑒定種類(lèi)豐富，5mC、6mA多種堿基修飾一次搞定，性?xún)r(jià)比高

?可進(jìn)行等位基因特異性甲基化檢測

?ONT 甲基化成功案例

使用ONT平臺進(jìn)行甲基化研究可謂日漸火熱，截至目前，已經(jīng)有十多篇文章發(fā)表，研究學(xué)者的熱情日益高漲。百邁客將目前見(jiàn)刊的文章給大家進(jìn)行了匯總，方便查閱

自從2017年開(kāi)啟ONT平臺研發(fā)立項，百邁客不斷探索與前進(jìn)，經(jīng)過(guò)一年多時(shí)間的沉淀與磨礪，百邁客Nanopore測序技術(shù)已經(jīng)逐步成熟并且達到穩定狀態(tài)。截至目前，百邁客已擁有3臺ONT PromethION，并建立超過(guò)上百種物種類(lèi)型的文庫，擁有大量的項目經(jīng)驗！無(wú)論是技術(shù)還是項目經(jīng)驗上，都實(shí)力過(guò)硬！

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