百邁客是國內首批推出推出空間轉錄組測序服務(wù)（百邁客邀您體驗新技術(shù)——空間轉錄組），以及國內研發(fā)植物空間轉錄組測序技術(shù)（百邁客新品-植物空間轉錄組挑戰與機遇），突破了物種的限制性，還在FFPE樣本上實(shí)現了客戶(hù)古董珍貴樣本的空間轉錄組測序（百邁客 10x Visium FFPE 空間轉錄組預售正式啟動(dòng)?。?，不僅拓展了空間轉錄組技術(shù)樣本適用范圍，也擴展了該技術(shù)在新領(lǐng)域的應用。
當然新技術(shù)的發(fā)展依賴(lài)于樣本的精細處理，特別是植物樣本處理和要求跟動(dòng)物樣本要求有一些不同，百邁客經(jīng)過(guò)十幾種物種、上百種組織類(lèi)型的測試，積累了大量的樣本處理經(jīng)驗，建立一套穩定組織樣本包埋方法，今天為各位老師獻上植物空間轉錄組實(shí)驗開(kāi)展中樣本準備相關(guān)資料，讓您的實(shí)驗不再局限于取材階段，推動(dòng)不同物種、不同組織類(lèi)型在空間基因表達模式的檢測，提供單細胞空間多維度探索動(dòng)植物生長(cháng)發(fā)育、抗逆應激、免疫反應、生物進(jìn)化等應用技術(shù)手段。
首先我們回顧一下在百邁客新品-植物空間轉錄組挑戰與機遇中提到的植物空間轉錄組實(shí)驗流程：新鮮組織取材-組織冷凍包埋-冷凍切片-甲苯胺藍染色-組織優(yōu)化-建庫測序-數據分析，因為植物組織結構上跟動(dòng)物組織存在很大差異性，在前期樣本準備取材工作就顯得尤為重要，接下來(lái)我們就植物組織樣本準備和冷凍包埋過(guò)程做一個(gè)總結：
樣品處理和包埋注意事項
(1) 客戶(hù)在制備樣本時(shí)，需要準備8-10個(gè)包埋塊/樣（質(zhì)檢、切片厚度調整、捕獲區域確定）：一份用于常規RNA提取，以確保樣本自身及樣本制備不存在問(wèn)題，當RNA RIN>7.0時(shí)，可進(jìn)行后續實(shí)驗；另外部分用于正常的切片厚度調整(10-50μm)和捕獲區域確定以及正式實(shí)驗；
(2) 目前Visium芯片捕獲區域大小為6.6×6.5mm2, 因此對組織包埋塊的大小有一定要求（≤6.5mm3） ,較小的組織可建議多個(gè)組織包埋在一起，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面，厚度滿(mǎn)足1mm以上即可
話(huà)不多說(shuō)，直接獻上百邁客植物空間轉錄組液氮異戊烷冷凍OCT包埋標準樣本制備詳細步驟攻略，我們先睹為快！
插入視頻：
相信看完了視頻，大家對組織變成白色的OCT包埋塊有了清晰的認識，那這個(gè)過(guò)程發(fā)生了哪些反應呢？小編這里給大家一一講解此次夢(mèng)幻傳奇之旅：
傳奇穿越之旅-裝備攻略
首先需要準備此次穿越之旅必備裝備，才能穿過(guò)重重阻撓，實(shí)現組織到包埋塊到切片的華麗蛻變。武器裝備材料如下：
1. OCT包埋劑（一級裝備）：美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑SAKURA ，貨號：4583，規格：118 mL/瓶，獲取途徑，各種武器店供應商有現貨，百元大洋左右，必不可缺，一瓶就可以完成上百次穿越旅行；
2. 包埋盒（一級裝備）：冷凍切片OCT包埋盒，7x7x5mm，物廉價(jià)美，某寶上只要20元左右就可獲取百件同等級別裝備；
3. 異戊烷（一級裝備）：CAS號78-78-4，規格500 mL，可直接購買(mǎi)，但裝備易燃，請小心使用；
4. 液氮、1xPBS、鑷子、剪刀、冰塊、培養皿（二級裝備）、吸水紙：可購買(mǎi)或自行配置。
圖1：裝備攻略示意圖
在無(wú)菌超凈臺中，用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織包埋盒）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育 5-10 分鐘，時(shí)間不宜太久，防止異戊烷凝結。
將包埋盒（冷凍切片OCT包埋盒，7x7x5mm）放置在冰上，標記包埋盒（組織放置的方向、樣品名稱(chēng)等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑（美國櫻花OCT冷凍切片包埋劑SAKURA ，貨號：4583，規格：118 mL/瓶），約1/4深度，微凝固后待用，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部；
圖2 包埋劑、沖洗液、包埋盒、異戊烷預處理示意圖
FAQ 1: 植物組織必須要進(jìn)行液氮異戊烷凍存嗎，能否用其它方法替代？
答：目前植物細胞具有細胞壁和液泡，細胞中存在大量水分更容易在低溫冷凍過(guò)程中形成冰晶，損傷植物組織細胞的結構形態(tài)，而且冷凍后植物樣品比動(dòng)物樣品硬度大，難以切片和保持植物組織結構的完整性。常用方法直接包埋法、液氮速凍法【1】以及繁瑣的FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定都無(wú)法快速得到較好的植物組織冷凍切片效果，這里推薦了液氮異戊烷冷凍-OCT包埋法（百邁客已經(jīng)完成近1000個(gè)樣本測試），液氮可以快速冷凍，組織在異戊烷中未直接接觸液氮既可以防止RNA降解，還避免形成晶體，防止組織形態(tài)受損。如果組織類(lèi)型硬度較大或者木質(zhì)化程度較高或者組織器官存在很多空隙樣本，可以推薦蔗糖溶液作為冷凍保護液，將植物組織放在合適濃度蔗糖溶液中固定，用對應濃度的蔗糖磷酸緩沖液浸洗，最后抽真空的方法可較大達到包埋切片效果。
FAQ 2: 植物組織包埋劑選擇，是否必須使用OCT包埋劑？
答：目前空間轉錄組推薦使用標準包埋劑就是OCT（櫻花牌，SAKURA ，4583），必須使用，已經(jīng)在Stefania[2][3]方法中得到驗證，在植物器官組織表面涂抹一層OCT組織包埋劑（水溶性乙二醇和樹(shù)脂組成）可以較好保存組織切片的完整形態(tài)，其優(yōu)點(diǎn)在前期提到過(guò)：
1）保留組織結構并在冷凍切片過(guò)程中提供結構支撐；
2）在切片過(guò)程中保持最*溫度，從而使切片光滑；
3）由于其水溶性，可與多種染色程序兼容。通過(guò)櫻花牌OCT包埋劑可以達到植物空間轉錄組測序樣本制備的要求。
FAQ 3：所有的試劑、包埋盒是否都需要在冰上操作？
答：是需要，為了降低植物組織RNA降解的可能，需要對相應的器具、試劑放在4℃環(huán)境中預冷，也就是前期一些工作需要在冰上操作完成，盡可能減少組織RNA的降解。
傳奇穿越之旅-取材攻略
從活體植株上取下新鮮目標區域組織置于培養皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀盡量將組織裁剪成 6.5mm3大?。ù笮∫m宜，現階段芯片大小為6.5×6.5mm2，一般組織覆蓋率達到芯片25%以上，低于25%建議多個(gè)包埋），利用預冷的蒸餾水將組織沖洗三次，用吸水紙輕輕吸干組織表面的溶液。
圖3 植物空間轉錄組組織樣本取材預處理示意圖
FAQ 4：可否使用其他植物組織緩沖液？
答：本方法推薦蒸餾水作為植物組織表面清洗緩沖液，不建議直接用1xPBS作為植物組織表面清洗緩沖液，為了維持組織形態(tài)結構原始穩定性，高濃度PBS會(huì )導致植物組織細胞容易收縮變形，選擇蒸餾水可以簡(jiǎn)單快速清洗干凈表面污漬。如果采用蔗糖溶液作為冷凍保護液，可以采取相應濃度蔗糖（1x PBS配置）做為植物清洗緩沖液。
FAQ 5：植物組織太小該如何包埋才能最大限度利用芯片覆蓋度？
答：為了保證最大限度利用芯片覆蓋度，解決組織樣本太小情況，這里推薦多個(gè)組織包埋在一起，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面，如上圖所示。另外一定要備注清楚方向和每個(gè)樣本形態(tài)結構，后續數據分析，需要清楚知道對應樣本切片位置，此時(shí)應該清楚備注每個(gè)樣本方向和位置信息。
傳奇穿越之旅-冷凍包埋
在冰上操作，用鑷子輕輕夾住組織，緩慢加入預冷的OCT包埋劑，直至OCT完全包裹組織，并調整組織在OCT中的位置，保證目標平面與切面水平一致，尤其是多個(gè)組織包埋一定要排列整齊，避免重疊在一起，此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡。
圖4 植物空間轉錄組組織OCT包埋示意圖
圖5 植物組織塊在包埋盒中示意圖
選擇最小規格包埋盒（7*7*5mm），組織塊合適大?。?.5mm3）
用鑷子夾緊包埋盒，使異戊烷沒(méi)過(guò)其底部但不淹沒(méi)整個(gè)包埋盒，不要使異戊烷浸入包埋盒內（組織不直接接觸異戊烷），當OCT由透明轉變?yōu)橥耆煌该鞯陌咨珘K狀時(shí)，組織基本完全凍結，取出包埋盒并放入-80℃冰箱保存（在室溫下，異戊烷溫度會(huì )迅速升高，冷凍過(guò)程中一旦異戊烷升溫，需要馬上置于液氮中重新冷卻）或直接進(jìn)行切片。冷凍時(shí)間可根據組織類(lèi)型和大小而變化。
圖6 植物組織塊液氮異戊烷冷凍示意圖
圖7 植物組織塊根、莖、胚芽鞘、花苞、芽等組織液氮異戊烷冷凍OCT包埋塊示意圖
傳奇穿越之旅-密封運輸
將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒直接保存在–80℃的密封容器中（一般利用錫箔紙包裹整個(gè)包埋盒或者扣下包埋塊將包埋塊放入50 mL離心管密封處理），并做好樣本信息標記，利用干冰運輸。
圖8 植物組織OCT包埋塊密封處理示意圖
FAQ：這種液氮異戊烷冷凍-OCT包埋的植物組織可以-80℃存放多久？
答：2個(gè)月。理論上密封處理后可以-80℃長(cháng)期保存，與動(dòng)物組織不同，植物組織脆弱性和結構特異性，液氮異戊烷冷凍-OCT包埋的植物組織在-80℃可以?xún)Υ?個(gè)月左右，就要進(jìn)行切片實(shí)驗和后續實(shí)驗，不然也會(huì )影響切片效果和RNA降解。
本期【空間轉錄組】植物組織到冷凍切片的傳奇穿越之旅基本上到此就告一段落，后需會(huì )繼續為大家奉上第二部傳奇之旅，詳細說(shuō)明植物組織冷凍切片如何實(shí)現空間位置基因表達信息的穿越，這其中又有經(jīng)過(guò)多少難關(guān)才能實(shí)現我們的最終穿越。欲知更多百邁客植物空間轉錄組后續實(shí)驗和實(shí)測數據分析，盡在下期分享，敬請期待。
百邁客空間轉錄項目經(jīng)驗
圖9. 百邁客空間轉錄組動(dòng)物冷凍組織切片HE染色
圖10. 百邁客空間轉錄組植物冷凍組織切片甲苯胺藍染色
百邁客空間轉錄組優(yōu)勢
◆多物種：人、鼠、哺乳動(dòng)物、植物等多物種均可開(kāi)展空間轉錄組檢測服務(wù)
◆多樣本類(lèi)型：冷凍組織、FFPE組織多種組織類(lèi)型都可以實(shí)現空間轉錄組測序
◆ 設備全：擁有冷凍切片機、石蠟切片機、多系統熒光顯微鏡，可滿(mǎn)足多樣本空間轉錄組高通量測序，一次性多通道、多樣本，實(shí)現高效空間轉錄組測序服務(wù)；
◆ 經(jīng)驗豐富：國內首批引進(jìn)10x visium 空間轉錄組測序平臺，目前累計成功制備50余種組織類(lèi)型、1000+例的空間轉錄組樣本
◆強大生信分析：可提供基本分析和高階分析，滿(mǎn)足個(gè)性化調整
◆全套服務(wù)：組織樣本切片、固定、透化、建庫、測序、數據分析全套服務(wù)
◆單細胞和空間云分析平臺：百邁客云平臺已經(jīng)研發(fā)快速高效的云平臺，可高效呈現高質(zhì)量文章圖表和對大數據進(jìn)行挖掘；
◆空間轉錄組&單細胞聯(lián)合分析：空間轉錄組多組學(xué)聯(lián)合分析，可近似實(shí)現單細胞分辨率空間轉錄組基因表達特征，交互式分析。
百邁客年末促銷(xiāo)，鉅惠來(lái)襲
活動(dòng)1：?jiǎn)渭毎鸛平臺驚爆價(jià)：17000元起/樣，5臺華為筆記本免費送（價(jià)值5600元） ；
活動(dòng)2：?jiǎn)渭毎D錄組活動(dòng)價(jià)：建庫測序分析項目買(mǎi)5送1，建庫測序項目享9折并送百邁客云分析賬號（價(jià)值2000元）；
活動(dòng)3：?jiǎn)渭毎庖呓M庫特惠價(jià)：TCR/BCR免費送，單細胞轉錄組免費升級到單細胞免疫組；
活動(dòng)4：空間轉錄組心動(dòng)價(jià)：建庫測序分析項目買(mǎi)3送1，建庫測序項目享9折并送百邁客云分析賬號（價(jià)值2000元）；FFPE樣本建庫測序項目享8.8折并送百邁客云分析賬號（價(jià)值2000元）
活動(dòng)5：?jiǎn)渭毎盗泻瀱胃＠簡(jiǎn)渭毎排嘤柊嗝赓M送（價(jià)值2400元）、峰會(huì )單細胞會(huì )場(chǎng)直播回放視頻免費送
參考文獻：
[1]陸振芳, 蔣素華, 江敏,等. 蝴蝶蘭花器官冰凍切片技術(shù)探討[J]. 河南農業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2019, 053(002):200-206.
[2] Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017 May 8;3:17061.
[3] Giacomello S, Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays. Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.
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