ONT技術(shù)新應用：精準鑒定RNA"加帽"事件 |

發(fā)布于 2021年2月18日

原文：NAD tagSeq for transcriptome-wide identification and characterization of NAD⁺-capped RNAs

發(fā)表雜志：Nature Protocols

影響因子：10.4

原文鏈接：https://sci-hub.ren/10.1038/s41596-020-0363-z

導讀

研究發(fā)現幾種NCIN（noncanonical initial nucleotides）可以給RNA“加帽”，并可能調節RNA的穩定性，轉錄和翻譯。NAD^?+是最近發(fā)現的NCIN之一，能夠給很多物種“加帽”。鑒定NAD⁺capped RNA（NAD-RNA）可能有助于揭示cap介導的調控機制。本文報道了一種稱(chēng)為NAD tagSeq的方法，用于NAD-RNA的全基因組分析。真核mRNA的5’末端一般都包含一個(gè)甲基化的帽子（m7G）,在轉錄起始形成。帽子不僅保護5’-3’核酸酶對mRNA的降解，而且可以形成一個(gè)cap-binding復合體，介導轉錄和翻譯過(guò)程。最近研究發(fā)現RNA能被一系列非典型核苷酸衍生物加帽，比如NAD⁺，FAD，dpCoA，表明存在另一種帽子介導的基因調控。這些調控可能包括改變RNA的穩定性，轉錄起始以及與參與mRNA轉運的蛋白質(zhì)相互作用。NAD^?+是細胞氧化還原反應中的核心輔酶，可能調節NAD-RNA的水平。但是，NAD-RNA的鑒定以及NAD ⁺cap介導的生物學(xué)功能在很大程度上是未知的。

1. NAD captureSeq

幾年前，開(kāi)發(fā)了NAD captureSeq，用于NAD-RNA的轉錄組范圍分析。在NAD captureSeq中，腺苷二磷酸核糖基環(huán)化酶（ADPRC）用于將NAD ⁺的煙酰胺部分替換為含炔烴的分子，稱(chēng)為4-戊炔-1-醇。然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應（銅催化的疊氮炔炔環(huán)加成（CuAAC））將炔基化產(chǎn)物與生物素疊氮化物連接。用鏈霉親和素樹(shù)脂富集生物素標記的RNA，然后制備通過(guò)二代測序技術(shù)（NGS）測序的cDNA文庫。陰性對照RNA樣品的處理方法相同，但不使用ADPRC。如果與陰性對照相比，在A(yíng)DPRC處理的樣品中富集了特定的RNA，則其某些轉錄本被認為是NAD ⁺?capped。通過(guò)NAD captureSeq，已在細菌，酵母，植物和人類(lèi)細胞中鑒定出NAD-RNA。缺點(diǎn)：非生物素化的RNA與鏈霉親和素樹(shù)脂的非特異性結合。由于NAD-RNA水平很低，因此非特異性結合可能會(huì )顯著(zhù)降低敏感性并引入誤差。在生物素標記過(guò)程中RNA的斷裂以及隨后cDNA文庫的構建導致NAD-RNA總體序列結構信息的丟失。

2. CapZyme-Seq

CapZyme-Seq用于鑒定含有NAD⁺cap或其他非經(jīng)典caps的RNA。在這種方法中，RNA decapping酶（例如來(lái)自大腸桿菌的NudC）用于水解NCIN cap以形成5′-單磷酸RNA。然后將decapped的RNA與RNA寡核苷酸連接，而無(wú)法將m7G capped RNA與寡核苷酸連接。然后將與RNA寡核苷酸連接的RNA反轉錄為cDNA，以通過(guò)高通量測序來(lái)擴增和鑒定NCIN-capped RNA。缺點(diǎn)：在CapZyme-Seq中，NudC不僅會(huì )水解NAD ⁺?cap，而且還會(huì )裂解其他非經(jīng)典caps，因此很難區分是否NAD-RNAs。

3. NAD tagSeq

與NAD captureSeq一樣，NAD tagSeq方法也使用ADPRC催化的反應和CuAAC反應來(lái)標記NAD-RNA。但是，NAD tagSeq不使用生物素標記NAD-RNA，而是在點(diǎn)擊化學(xué)反應中使用與合成RNA tag綴合的疊氮化物，從而使NAD-RNA與RNA tag連接（圖1）。然后，通過(guò)利用ONT平臺直接對RNA進(jìn)行測序。RNA tag可作為NAD-RNA的標識符，這意味著(zhù)假定在其5’端包含tag序列的RNA read被NAD⁺capped。RNA tag還可以用于通過(guò)與具有互補序列的DNA寡核苷酸雜交，來(lái)富集標記的RNA，富集步驟是可選的。通過(guò)富集，可以增加NAD-RNA的測序覆蓋率。如果不進(jìn)行富集，則通過(guò)納米孔測序來(lái)識別標記和非標記轉錄物，從而獲得NAD-RNA與總轉錄組的比率。NAD tagSeq方法還可以對來(lái)自相同基因的NAD-RNA和總轉錄本的相對豐度進(jìn)行定量。標記步驟之后，通過(guò)使用聚腺苷酸化酶將poly（A）尾巴添加到所有RNA中，因為只有含poly（A）的RNA可以通過(guò)牛津納米孔測序進(jìn)行測序（圖1）。結果，NAD-RNA在5’端被RNA tag標記，在3’端被聚腺苷酸化，而其他RNA僅進(jìn)行聚腺苷酸化。然后，對所有RNA與RTA連接，逆轉錄和連接RNA測序接頭。最后，通過(guò)Nanopore直接進(jìn)行RNA測序。Guppy給出的reads后，需要鑒定NAD-RNA。堿基識別無(wú)法識別1,2,3-triazole附近的序列；因此，使用來(lái)自每個(gè)基因的tag和untagged的RNA分別代表NAD-RNA和noncapped RNA。由于tag RNA的長(cháng)度為40個(gè)核苷酸，并且連接會(huì )影響堿基識別，因此對前40個(gè)核苷酸中具有12個(gè)連續tag RNA核苷酸的reads，將它們歸類(lèi)為tag RNA。然后將reads與參考基因組和轉錄組比對，以找出只存在于A(yíng)DPRC⁺樣品中的基因。標記的NAD-RNA的結構可通過(guò)Integrative Genomics Viewer可視化。

圖1 NAD tagSeq的流程

4. NAD tagSeq實(shí)驗設計

（1）使用model NAD-RNA驗證標記過(guò)程

為了分析RNA tag的標記效率，作者使用T7 RNA聚合酶通過(guò)體外轉錄合成了NAD-RNA模型（38個(gè)核苷酸）。NAD-RNA模型的轉錄是由T7 II類(lèi)啟動(dòng)子驅動(dòng)，并且只有第一個(gè)轉錄的核苷酸是腺苷，因此NAD +可以在5’末端的轉錄本中摻入。然后合成NAD-RNA使用PAGE凝膠純化。使用PAGE凝膠進(jìn)一步監測model NAD-RNA的純度（圖2）。然后，model NAD-RNA與4-pentyn-1-ol進(jìn)行ADPRC催化的化學(xué)酶反應，與tagRNA-疊氮化物（25個(gè)核苷酸）進(jìn)行CuAAC反應。通過(guò)PAGE凝膠檢測產(chǎn)物，其中將缺乏ADPRC（ADPRC-）的反應用作陰性對照。

?圖2 純化的model NAD-RNA的凝膠電泳

（2）用于NAD tagSeq的RNA樣品制備

RNA的片段化和降解會(huì )降低使用NAD tagSeq識別NAD-RNA的效率。對于RNA樣品制備，建議使用新鮮的組織提取RNA?；蛘?，可以在獲得后立即在液氮中冷凍組織。建議在tag實(shí)驗中使用100μg?RNA。

（3）用RNA?tag標記NAD-RNA

為了進(jìn)行反應，首先在A(yíng)DPRC催化下，用接頭修飾model NAD-RNA或總細胞RNA。然后，與炔烴相連的RNA與特定的tagRNA-疊氮化物（40個(gè)核苷酸）進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應。陰性對照，除了不添加ADPRC以外，以相同方式處理樣品。陰性對照的結果有助于評估RNA分子非特異性標記產(chǎn)生的噪音。

（4）總RNA的聚腺苷酸化

納米孔直接RNA測序需要RNA包含poly（A）尾巴。如果將真核mRNA用作輸入樣品，則不需要聚腺苷酸化步驟。但是，如果研究的重點(diǎn)是其他類(lèi)型的無(wú)聚腺苷酸尾巴的RNA，則需要進(jìn)行聚腺苷酸化。該步驟由poly（A）聚合酶催化，向每個(gè)RNA添加poly（A）尾，然后使用oligo dT磁珠純化RNA。

（5）富集NAD-RNA用于深度測序

此步驟是可選的，可進(jìn)行此操作以增加NAD-RNA的測序覆蓋度。標記的NAD-RNA被固定在磁珠上的DNA寡核苷酸富集，并具有與RNA tag互補的序列。

（6）文庫制備和利用MinION進(jìn)行測序

通常，使用200–500 ng的RNA制備測序文庫。按照ONT公司的直接RNA測序方案，將RNA樣品與RTA連接，逆轉錄并與測序接頭連接，所有這些都可以通過(guò)納米孔直接RNA測序試劑盒完成。然后，可以在Nanopore測序設備上對生成的文庫進(jìn)行測序。使用MinKNOW軟件和Guppy數據處理工具包進(jìn)行堿基識別。

（7）從測序reads中鑒定NAD-RNA

盡管堿基識別軟件無(wú)法識別1,2,3-三唑鍵附近的序列，但Guppy給出的reads仍可通過(guò)tag RNA來(lái)確定NAD-RNA。在NAD tagSeq的原始應用程序中，作者開(kāi)發(fā)了Python腳本，并結合了諸如Guppy和Minimap2（ref.）之類(lèi)的可用工具來(lái)實(shí)現數據分析。為了提高該方法的性能，建立了稱(chēng)為T(mén)agSeqTools的計算流程。在這里，介紹了一組用于識別和定量NAD-RNA的詳細過(guò)程，該過(guò)程使用TagSeqTools和現有軟件（例如FastQC）。使用TagSeqTools中的TagSeek模塊區分NAD-RNA和非NAD RNA。

從TagSeek步驟生成的帶標簽和不帶標簽的reads可以接受TagSeqQuant，它使用Minimap2的默認比對參數。在TagSeqQuant中，還通過(guò)FastQC對reads進(jìn)行質(zhì)量檢查，并生成一個(gè)html文件以顯示測序質(zhì)量。經(jīng)過(guò)上述分析步驟后，將生成NAD-RNA和非NAD-RNA的基因覆蓋文件，以進(jìn)行IGV可視化（圖3），并生成基因和isoforms的計數表以進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖3 NAD-RNA和noncapped-RNA reads可視化圖

5. NAD tagSeq的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)勢：首先，NAD tagSeq可以使用5’端的RNA tag作為有效的工具，以過(guò)濾掉一些假陽(yáng)性。在NAD captureSeq中，將非特異性結合鏈霉親和素樹(shù)脂的RNA分子與生物素標記的RNA一起轉換為cDNA文庫。非特異性結合問(wèn)題也發(fā)生在NAD tagSeq中。但是，NAD tagSeq可以使用直接RNA測序通過(guò)RNA tag的存在來(lái)區分NAD-RNA與其他非特異性結合的NAD-RNA。其次，NAD tagSeq不需要像NAD captureSeq一樣的PCR程序，通過(guò)避免PCR引起的偏倚，可以使NAD-RNA的定量更加準確。NAD tagSeq還允許定量總轉錄本中NAD-RNA的絕對豐度和相對豐度。第三，NAD tagSeq比NAD captureSeq更簡(jiǎn)單，因為可以在標記后直接識別RNA，因此省去了制作cDNA文庫的整個(gè)過(guò)程。

第四，NAD tagSeq可以揭示NAD-RNA的整體序列。ONT測序技術(shù)允許將RNA分子從3’端到5’端測序。因此，可以揭示RNA分子的序列。它允許分析cap如何通過(guò)轉錄后修飾（如選擇性剪接或5’非翻譯區）調節RNA功能。

第五，將來(lái)可能會(huì )應用通過(guò)合成RNA tag標記NAD-RNA然后進(jìn)行直接RNA測序的想法，以開(kāi)發(fā)類(lèi)似的方法來(lái)鑒定其他NICN-capped RNA，可以開(kāi)發(fā)特定的酶和/或點(diǎn)擊化學(xué)反應來(lái)標記其他NCIN capped RNA。

局限性：納米孔測序從3’端到5’端，有時(shí)會(huì )導致reads被截斷，這意味著(zhù)RNA的5’區域可能未測序。因此，某些沒(méi)有RNA tag的reads可能來(lái)自NAD-RNA，這會(huì )引入一些假陰性。

此外，如果在標記之前不進(jìn)行聚腺苷酸化步驟，RNA的斷裂（例如在銅離子存在下的點(diǎn)擊化學(xué)反應期間）可能會(huì )導致假陰性。

NAD?tagSeq的另一個(gè)缺點(diǎn)是，由于ONT芯片的成本很高，它比NAD?captureSeq更為昂貴。此外，Oxford Nanopore測序平臺在對小RNA進(jìn)行測序方面存在局限性。獲得的短測序reads（不包括poly（A）尾部和RNA標簽序列）約為80個(gè)核苷酸，這增加了一些小NAD-RNA可能被該分析遺漏的可能性。推測Illumina測序也可用于NAD tagSeq。但是，還需要進(jìn)一步測試逆轉錄酶是否可以通過(guò)RNA tag和NAD cap之間的joint以到達RNA tag區域。

總結

NAD tagSeq結合ONT direct RNA檢測方案可用于全基因組范圍內的鑒定和定量，包括真核生物和原核生物在內的不同生物體中的NAD RNA。它可用于比較不同樣品中的NAD-RNA圖譜，并分析細胞NAD-RNA的總體水平和單個(gè)NAD-RNA的水平。如果跳過(guò)tag RNA的富集，則該方法可產(chǎn)生同一基因中NAD-RNA的豐度和總轉錄本的信息。此外，NAD-RNA的整個(gè)序列結構可以通過(guò)長(cháng)讀測序技術(shù)揭示出來(lái)。該技術(shù)可用于分析不同生理條件下的NAD-RNA，并將其與總轉錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，以揭示NAD RNA在介導基因表達中的可能作用。