蔬菜基因定位的方法

表型調查：

分別2014、2015和2017年種植親本、F1及DH群體，2次田間重復，每個(gè)重復種植3株；由于2014年環(huán)境影響表型數據缺失度較高，如果用這個(gè)數據可能影響QTL定位分析，因此，后續作者利用BLUE分析來(lái)解決這種由于多年表型數據偏差，使得3年數據均得到利用。因空心莖這個(gè)表型調查比較困難，所以只簡(jiǎn)單的分為空心莖和非空心莖2種類(lèi)型。

方法：SLAF測序，HighMap構建遺傳圖譜，IciMapping進(jìn)行QTL定位，MapQTL進(jìn)行BLUE分析及QTL定位

1、SLAF遺傳圖譜

測序數據與 TO1000基因組進(jìn)行比對，比對率為75.99%，有24.01%是沒(méi)有比對上的，比對率較低主要是可能由于2種原因導致——基因組差異和結構變異。因為西蘭花和甘藍型TO1000是2個(gè)品種，由此可見(jiàn)一個(gè)物種中一個(gè)品種的基因組并不能包含這個(gè)物種所有的信息。

開(kāi)發(fā)了185,349個(gè)SLAF標記，其中，20,250個(gè)SLAF標記可以成功分型，最終上圖的標記為4787個(gè)，分布于9個(gè)LG中，構建一張平均圖距為0.22cM的遺傳圖譜（如下圖），標記間最大gap超過(guò)10cM，這可能是由于小孢子培養構建DH群體的過(guò)程中，可能某種基因型更容易形成胚胎和再生植株，從而產(chǎn)生偏分離或某段染色體區域中無(wú)個(gè)體發(fā)生重組。

圖2 西蘭花遺傳圖譜

2、QTL定位

利用3年表型數據定位到8個(gè)相關(guān)位點(diǎn)，其中QHS.C09-1的表型變異率為15.6%（叮咚——有主效位點(diǎn)了，盤(pán)它），其余位點(diǎn)均為小于10%。還有上面的小助手BLUE也幫助找到了一個(gè)位點(diǎn)QHS.C09-2，其表型變異率為14.1%。其中QHS.C09-1和QHS.C09-2存在部分重疊，因此認為QHS.C09-2也是與空心莖相關(guān)的主效QTL。

圖3 QTL定位結果

圖4 BLUE分析結果

開(kāi)發(fā)了406,563個(gè)SLAF標簽，171,413個(gè)是為多態(tài)的，其中94,733個(gè)SLAF標簽可成功分型，最終構建了含有9,038 個(gè)標記的遺傳圖譜，12個(gè)LGs，總圖距為1,586.78 cM，平均圖距為0.18 cM?；蚪M與遺傳圖譜共線(xiàn)性均≥0.9。

2、QTL定位

雙親、F1及F2:3家系，3年3個(gè)環(huán)境下的表型調查，發(fā)現雙親均為極端類(lèi)型，而F1和F2:3家系均趨向于中親類(lèi)型，認為花期和單節花數為數量性狀。利用R/QTL定位到6個(gè)QTL，3個(gè)與花期相關(guān)，3個(gè)與單節花數相關(guān)。他們分別能夠解釋46.35-50.37%和99.13-99.76%的花期和單節花數的表型變異。利用QTL.gCIMapping.GUI定位到了2個(gè)與單節花數相關(guān)的新微效QTL。

3、候選基因預測

花期相關(guān)基因：針對主效QTL——Ft2.1進(jìn)行重點(diǎn)分析，它處于遺傳圖譜上的區間為0.763cM，對應的Zunla-1基因組上物理區間為210Kb，包含25個(gè)基因，其中存在之前鑒定到的Capana02g000700基因，編碼花器官同源異型蛋白。進(jìn)化分析表明Capana02g000700的同源基因，金魚(yú)草LIP1和LIP2、擬南芥APETALA2和辣椒CaAP2，均在花器官發(fā)育階段存在重要作用。同時(shí)，比對雙親間序列差異，發(fā)現8個(gè)SNP標記和1個(gè)6bp的InDel標記，這導致親本CA1存在2個(gè)氨基酸的缺失和5個(gè)氨基酸的改變。繼DNA層面分析之后，RNA層面的分析qRT-PCR和RNA-seq表明，這個(gè)基因在雙親間存在差異表達，且在花器官中表達量最高，最終認為Capana02g000700就是控制花期的候選基因。

單節花數相關(guān)基因：主效QTL——Mf2.1，它處于遺傳圖譜上的區間為0.382cM，對應的Zunla-1基因組上物理區間為1400Kb，包含98個(gè)基因。單節花數是基于芽尖的分生組織變化產(chǎn)生的差異，已由報道表明營(yíng)養生長(cháng)轉變?yōu)樯成L(cháng)過(guò)程中，產(chǎn)生明顯表達差異的為轉錄因子（TF）。且Mf2.1定位區間內也包含很多TFs。結合已報道的中間營(yíng)養分生組織、過(guò)渡分生組織和成花分生組織的轉錄組數據，發(fā)現在過(guò)渡分生組織中多數基因表達是上調，其中包含不同家族的TF，因此將這些上調的TF作為控制單節花數的候選基因。

圖6 主效QTLFt2.1的局部連鎖圖和基因表達分析

4、基因共表達分析

WGCNA（加權基因共表達網(wǎng)絡(luò )分析），是一種分析多個(gè)樣本表達模式的分析方法。該分析方法旨在尋找協(xié)同表達的基因模塊(module)，并探索基因模塊與關(guān)注的表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，以及網(wǎng)絡(luò )中的核心基因。

利用之前研究的不同發(fā)育階段和不同組織部的WGCNA分析結果，找到了花器官發(fā)育特定模塊，其中包含107個(gè)基因。這些基因中10個(gè)為T(mén)Fs，其中就包含已鑒定的Capana02g000700，這表明這些TFs可能與花發(fā)育的轉錄調控相關(guān)。這107個(gè)基因中，發(fā)現9個(gè)基因與Capana02g000700高度共表達，分為3個(gè)家族，且其功能均與花發(fā)育相關(guān)。上述，均表明Capana02g000700通過(guò)抑制靶基因和/或TF表達來(lái)控制花器官發(fā)育，進(jìn)而影響花期。

圖7 基因共表達網(wǎng)絡(luò )分析

1. 利用F2:3家系對F2群體表型進(jìn)行多年考查；
2. 利用BLUE分析解決當不同年份的環(huán)境變化大的問(wèn)題；
3. 利用WGCNA找到目標性狀調控網(wǎng)絡(luò )和其中的核心基因。