全長(cháng)轉錄組解析淡水花羔紅點(diǎn)鮭Toll-like受體和補體系統的免疫作用機制

研究背景

花羔紅點(diǎn)鮭是溯河產(chǎn)卵魚(yú)類(lèi)，在泛太平洋分布。中國東北部山區河流中的花羔紅點(diǎn)鮭終身生活在淡水中。早期研究主要集中于花羔紅點(diǎn)鮭的生長(cháng)和地理分布，而對于淡水花羔紅點(diǎn)鮭抗細菌感染的免疫系統的影響知之甚少。為了探討花羔紅點(diǎn)鮭適應淡水對其免疫系統的影響，特別是補體系統（complement system）和Toll-like受體（toll-like receptors，TLR）途徑的影響，本文對細菌侵染的中國淡水花羔紅點(diǎn)鮭進(jìn)行全長(cháng)轉錄組研究。

材料和方法

• 材料
  中國通化市鴨綠江上游支流取魚(yú)（184.6±23.4g），將魚(yú)隨機分為兩組，腹腔注射嗜水氣單胞菌或相應體積的0.9%鹽水。
• 全長(cháng)轉錄組測序
  腹腔注射后24小時(shí)，從細菌注射組中處死3條魚(yú)，收集肝臟和脾臟組織等量混合構建全長(cháng)轉錄組文庫。
• 測序平臺
  北京百邁客生物科技有限公司PacBio RS II 測序平臺，構建3個(gè)文庫，0-2kb，2-3 kb和3-6 kb。
• qPCR驗證
  分別于注射后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h各處死3條魚(yú)，將肝臟和脾臟組織立即液氮速凍，保存-80℃。

 

研究結果

 

1、cDNA文庫特征
以中國淡水花羔紅點(diǎn)鮭為材料，將細菌注射魚(yú)腹腔法，取肝臟和脾臟等量混樣構建cDNA文庫測序。去除接頭序列和低質(zhì)量序列（＜50 bp）之后，產(chǎn)生了超過(guò)14.88 GB clean data，總數為7,728,364。0-2kb，2-3 kb和3-6 kb分別產(chǎn)生4,565,697、2,087,033和1,075,634 clean data。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制、數據過(guò)濾和去除冗余后，采用31233個(gè)高質(zhì)量轉錄本獲得27,829個(gè)轉錄本。共鑒定出24,541個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中17,670個(gè)是完整的。

2、轉錄本的功能注釋和分類(lèi)
對27,829個(gè)轉錄本進(jìn)行數據庫功能富集和分類(lèi)注釋分析，25,809個(gè)轉錄本被注釋。NCBI-Nr數據庫比對顯示，轉錄本匹配到一系列物種（圖1）。Nr數據庫中比對上轉錄本共有25,653個(gè)(92.18%)，52.04% 轉錄本與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）相似，其次是大西洋鮭（Salmo salar）(23.53%)和梭子魚(yú)（Esox lucius）(14.01%)，其余匹配的物種不到10%。GO數據庫注釋16,612個(gè)（59.69%）轉錄本，富集到兩個(gè)與免疫相關(guān)的亞類(lèi)，分別是“響應刺激”（3,124個(gè)轉錄本）和“免疫系統過(guò)程”（851個(gè)轉錄本）（圖2）。將轉錄本與KEGG數據庫比對，共有16917個(gè)轉錄本富集到271個(gè)通路。免疫相關(guān)的KEGG通路主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用（106個(gè)基因）、Toll-like受體信號通路（51個(gè)基因）、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò )（20個(gè)基因）等。

圖1 中國花羔紅點(diǎn)鮭肝脾cDNA文庫Nr注釋

圖2 轉錄本GO分類(lèi)

3、免疫相關(guān)基因驗證和鑒定
重新測序驗證了中國原生淡水花羔紅點(diǎn)鮭C4基因（S.m-C4）的完整ORF，長(cháng)度為5160bp，編碼具有1719個(gè)氨基酸(aa)殘基的蛋白質(zhì)。通過(guò)兩兩氨基酸序列比較結果顯示，Salmo salar與中國花羔紅點(diǎn)鮭的同源性最高(94.4%)，相似度最高(88.3%)。
確認了中國原生淡水花羔紅點(diǎn)鮭TLR5基因(S.m-TLR5)的cDNA序列。長(cháng)度為3123 bp，包括207-bp 5’非翻譯區域(UTR)，?3’-UTR長(cháng)度為279 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF) 2640 bp編碼879個(gè)氨基酸(圖4)，S.m-TLR5蛋白理論分子量為100.6 kDa。

圖4 S.M－TLR5的核苷酸和預測的氨基酸序列

4、多重序列比對
多重序列比對表明，硬骨魚(yú)和人的氨基酸高度保守。推導出的S.m-C4蛋白具有α-β連接子序列RXXR(在殘基668-671)和α-γ。連接序列RRXR（殘基1426-1429），其中C4氨基酸鏈被切割成三個(gè)鏈（α，β和γ鏈）。此外，保守的硫酯（GCGEQ）位點(diǎn)也定位在殘基1001至1005（圖5）。預測了TLR5由前21個(gè)氨基酸組成的信號肽和由14個(gè)氨基酸組成的跨膜螺旋。在膜結合型TLR5的LRR-CT中發(fā)現4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，此外，還有9個(gè)蛋白結合區。結果表明，S.m-TLR5蛋白與銀大麻哈魚(yú)（91.5％）、大西洋鮭（91.7％）和衰白鮭（89.6％）的同源性較高，與鯉魚(yú)（48.1％）和金鯽（48.8％）的同源性較低。

圖5 中國淡水花羔紅點(diǎn)鮭與其它物種C4氨基酸序列的多重比對

5、重建系統發(fā)育
為了探究S.m-C4和S.m-TLR5免疫基因在魚(yú)類(lèi)體內的系統發(fā)育情況，中國淡水花羔紅點(diǎn)鮭與另外23條硬骨魚(yú)、兩條鯊魚(yú)和一條腔棘魚(yú)用于C4基因研究。重建貝葉斯系統發(fā)育中，四種鮭魚(yú)形魚(yú)類(lèi)組合在一起，具有較高的后驗概率（PP）(圖7)。同時(shí)三種鯉形目魚(yú)類(lèi)和兩種鰓形目魚(yú)類(lèi)分別用1.00 PP進(jìn)行分組，形成骨鰾總目分支。這一結果與傳統分類(lèi)學(xué)和系統發(fā)育相一致。硬骨魚(yú)分為鰓形目、原鰓形目、鰓形目和棘鰓目四支，其中，兩條鯊魚(yú)是外群。

圖7 重建C4基因貝葉斯系統發(fā)育

6、分子進(jìn)化分析
首先，利用位點(diǎn)模型探討C4基因中是否存在因其不同的分類(lèi)地位和生存環(huán)境而正向選擇的位點(diǎn)。在模型中，只有M1a-M2a和M7-M8能夠檢測到正向選擇位點(diǎn)。M7-M8檢測到PP > 0.95的10個(gè)正向選擇位點(diǎn)，其中9個(gè)位點(diǎn)也被M1a-M2a檢測到，表明魚(yú)C4基因的正向選擇。其次，利用分枝模型來(lái)探究這些正向選擇事件是否發(fā)生在特定的魚(yú)類(lèi)譜系上，從而導致現在的魚(yú)或者祖先魚(yú)類(lèi)。最后，利用分枝位點(diǎn)模型，在特定的現在和祖先譜系中檢測了這些位點(diǎn)。對于C6基因，M7-M8在正選擇壓力下僅檢測到一個(gè)位點(diǎn)，而花羔紅點(diǎn)斑鮭或其他冷水魚(yú)中的分支位點(diǎn)未檢測到任何正選擇位點(diǎn)（表8）。

表8 魚(yú)C4和C6基因的位點(diǎn)、分枝和分枝位點(diǎn)模型試驗

7、qPCR驗證相對表達量
為探討這兩種免疫基因在細菌侵入的免疫應答，采用定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）技術(shù)，觀(guān)察注射后96h內肝、脾臟相關(guān)基因的表達。對于鹽水處理組，即對照組，S.m-C4基因在研究的所有時(shí)間點(diǎn)肝臟中均無(wú)顯著(zhù)差異（圖9）。對于嗜水氣單胞菌注射組，即實(shí)驗組，肝臟在24小時(shí)有顯著(zhù)增加（p=0.04），在12小時(shí)和72小時(shí)出現兩個(gè)峰值，邊緣顯著(zhù)。在6h、12h、24h和72h，實(shí)驗組與對照組有顯著(zhù)性差異。對照組脾臟中S.m-C4基因的相對表達上下波動(dòng)，8個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著(zhù)，實(shí)驗組脾臟中S.m-C4基因的相對表達除72h外，其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異，與細菌注射組0 h相比減少59.6%。

圖9 嗜水氣單胞菌或鹽作用肝臟中S.m-C4相對表達量

 

結論

 

1、本研究以細菌侵染后中國淡水花羔紅點(diǎn)斑鮭為材料，構建了全長(cháng)轉錄組文庫。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制，從31,233個(gè)高質(zhì)量轉錄本中共獲得27,829個(gè)轉錄本，并鑒定出24,541個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中17,670個(gè)完整。

2、將27,829個(gè)轉錄本用于功能富集和分類(lèi)分析，25,809個(gè)轉錄本得到注釋。相對于適應免疫基因，注釋到更多先天免疫相關(guān)基因。參與Toll-like受體信號通路的基因多于補體和凝血級聯(lián)，表明Toll-like受體在細菌侵染的淡水花羔紅點(diǎn)鮭中發(fā)揮更重要的免疫作用。

3、為驗證全長(cháng)轉錄組鑒定基因序列準確性，選擇S.m-C4和S.m-TLR5進(jìn)行重新測序驗證，進(jìn)一步證明測序結果的準確性。

4、中國淡水花羔紅點(diǎn)鮭中TLR和補體系統顯著(zhù)數量差異，可能是TLR和補體系統進(jìn)化壓力模式的不同所致，以TLR3和TLR5以及C4和C6為代表，它們分別處于純化選擇和正選擇壓力。

 

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