基因功能研究思路與技術(shù)—植物篇

高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，使得基因數據量直線(xiàn)飆升，隨之而來(lái)的就是對基因功能研究的新挑戰。做完測序我們得到感興趣的基因或ncRNA，并對它們的功能、作用機制做生信方面的分析后，如果我們要深入研究下去，就需要依靠分子實(shí)驗手段做篩選到的感興趣基因或ncRNA的功能及作用機制方面的研究。
基因或ncRNA研究組成模塊本質(zhì)上是差不多的，都是由生物學(xué)問(wèn)題、分子（基因或ncRNA）、功能和機制、通路組成，而每個(gè)層面又有針對于不同情況的具體的實(shí)驗技術(shù)，而文章的千變萬(wàn)化就在于這些模塊之間、這些技術(shù)之間的不同組合。

01.表達量檢測、定位、全長(cháng)鑒定：縮小范圍，找到重點(diǎn)

對于很多研究，第一步一般都會(huì )去驗證從測序結果中篩選到的基因或ncRNA，主要驗證要研究的基因或ncRNA的表達量（RT-qPCR、northern、WB）、
表達在組織或亞細胞間的特異性（RT-qPCR、northern、FISH、GFP融合蛋白、核質(zhì)分離）、序列的準確性及是否有新的可變剪切（5’/3’RACE）等。

這一步可以縮小研究的范圍，有時(shí)候也會(huì )發(fā)現新的興趣點(diǎn)，比如這篇Journal of Experimental Botany的文章中，作者發(fā)現了slctr4基因的一個(gè)新的可變剪切命名為slctr4vs3，并且在slctr4的3個(gè)可變剪切中只有slctr4sv3與sly-mir-1917呈負相關(guān)
（負相關(guān)是miRNA調控靶基因最常見(jiàn)的方式，說(shuō)明這個(gè)miRNA很可能調控這個(gè)基因），在后期的Y2H實(shí)驗和BiFC實(shí)驗中發(fā)現slctr4sv3與SlEIN2互作，這樣就打通了miRNA-1917-slctr4-SlEIN2這樣一條通路。

02.基因功能研究

做完這部分基礎的驗證后，就需要驗證基因或ncRNA的功能，功能的驗證主要分兩類(lèi)：獲得性研究和缺失性研究，獲得性研究即通過(guò)VIGS或遺傳轉化/轉基因讓目的基因過(guò)表達，缺失性研究即用RNAi、CRISPR/Cas9等技術(shù)讓目的基因沉默或突變?yōu)闊o(wú)功能基因。通過(guò)這部分研究可以驗證目的基因的功能。

比如這篇發(fā)表在Developmental Cell的章中對lncRNA COLDWRAP的RNAi敲除品系表現出減少的春化反應，將COLDWRAP轉入COLDWRAP突變體后，COLDWRAP表達恢復了春化反應。

03.作用機制研究：文章容易出彩的地方

目的基因或ncRNA研究完，進(jìn)一步就需要探討目的基因是如何發(fā)揮作用的，比如上述lncRNA COLDWRAP，是通過(guò)什么方式對春化作用產(chǎn)生影響的呢？這就需要研究COLDWRAP的作用機制，很多高分文章都是這部分的研究非常精彩！
比如，下面這篇發(fā)表在Plant Cell上的文章，作用機制部分研究就比較精彩。
作者先在體外，用酵母雙雜交鑒定FRI蛋白互作的蛋白，發(fā)現FRI的N端區域與其與LRB1和LRB2的相互作用是重要的，FRI的C端區域和CUL3A的N端區域是它們相互作用所必需的。之后用GST pull-down驗證酵母雙雜交結果。

之后在體內，用BiFC在體內驗證定位、酵母雙雜交、GST pull-down結果，用co-IP分析瞬時(shí)表達FRI和CUL3A再次驗證相互作用。

最后通過(guò)體外降解試驗發(fā)現FRI通過(guò)泛素-26蛋白酶體途徑降解，表明CUL3A和LRB1 / 2是FRI降解所必需的，FRI降解是CUL3A，LRB1 / 2和蛋白酶體依賴(lài)性過(guò)程介導。最終得出蛋白酶體介導的FRI降解調節擬南芥春化過(guò)程中開(kāi)花的結論。

?04.把生物學(xué)故事串起來(lái)

好的研究最終能依靠轉錄因子、信號通路等把研究結果串起來(lái)，系統地解釋一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題。

比如上面談到的Plant Cell的文章，作者發(fā)現轉錄因子WRKY34的轉錄迅速被冷應激誘導，之后構建pCUL3A-LUC載體和W-box區域突變pCUL3A-LUC載體，與WRKY34共注射入煙草和擬南芥葉原生質(zhì)體，來(lái)驗證WRKY34以預測的W-box與CUL3A啟動(dòng)子結合以增加其CUL3A轉錄，而CUL3A又介導FRI降解調節擬南芥春化過(guò)程中的開(kāi)花，從而把生物學(xué)故事由冷誘導—WRKY34轉錄—CUL3A轉錄—FRI降解—擬南芥春化過(guò)程中的開(kāi)花這樣一條線(xiàn)串起來(lái)。

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