DNA測序技術(shù)在過(guò)去的40年中，經(jīng)歷了巨大的改進(jìn)與變化。早在1977年，首次報道了Sanger和Maxam–Gilbert測序方法，Sanger測序的最大序列長(cháng)度約1 kb。其對DNA總量的要求較高，一般通過(guò)克隆靶標DNA序列并連接載體，進(jìn)而通過(guò)原核細胞大腸桿菌(E. coli)擴增（當時(shí)基因組De novo采用BAC文庫測序方式），其讀長(cháng)短且耗時(shí)；NGS（Next-Generation Sequencing )二代測序包含很多技術(shù)平臺，其特征是對大量的DNA分子并行測序，多年來(lái)已有4個(gè)主要的NGS平臺投入商業(yè)使用：羅氏454平臺, Illumina GA/Solexa 平臺, ABI SOLiD平臺和Life Torrent平臺。在過(guò)去的10年中，Illumina因其低成本，高速和高產(chǎn)而成為測序市場(chǎng)的主要供應商，Illumina測序平臺具有廣適性，因此NGS已廣泛用于探索基因組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括腫瘤學(xué)，微生物學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，宏基因組學(xué)及醫學(xué)，環(huán)境和農業(yè)研究等，隨時(shí)其廣泛的應用，其劣勢也逐漸的突顯，即：二代測序（Illumina為代表）讀長(cháng)短仍然是生物學(xué)研究的重要瓶頸，這限制了許多生物學(xué)研究的準確性，尤其是在基因組組裝研究中。在片段重復（segmental duplication），結構變異（SV，structural variations）或旁系同源區段分析中使用短讀長(cháng)測序可能會(huì )導致大量假陽(yáng)性。盡管測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析在進(jìn)步，但大型基因組的從頭組裝仍然具有挑戰性。自2015年起，以PacBio和Nanopore為代表的長(cháng)讀長(cháng)測序技術(shù)開(kāi)始在動(dòng)植物基因組De novo中初露鋒芒（圖1 A和B）。

圖1 不同測序技術(shù)讀長(cháng)，準確性及基因組連續性評估

一、三代長(cháng)讀長(cháng)單分子測序技術(shù)的發(fā)展

?長(cháng)讀長(cháng)單分子測序技術(shù)（Long read single-molecule sequencing technology）又稱(chēng)第三代測序技術(shù)TGS（Third-Generation Sequencing），早在2004年，由美國太平洋生物科學(xué)公司Pacific Biosciences (PacBio)?創(chuàng )立的實(shí)時(shí)（SMRT）測序是較早被廣泛使用的長(cháng)讀測序技術(shù)，SMRT測序產(chǎn)生的Reads可達到約200 kb。其提供了技術(shù)上的優(yōu)勢，以鑒定遺傳變異并進(jìn)一步研究其基因功能，同時(shí)作為動(dòng)植物基因組組裝日臻進(jìn)步完善的主要驅動(dòng)力，自2015年，首篇純PacBio三代數據組裝復活草（Nature. 2015）基因組見(jiàn)刊Nature，開(kāi)啟了三代動(dòng)植物基因組De novo的紀元。與Sanger測序和NGS測序類(lèi)似，PacBio測序同樣采用邊合成邊測序的方式，以其中一條DNA鏈為模板，通過(guò)DNA聚合酶合成另外一條鏈（圖2 A和B）。PacBio測序平臺相繼推出RS II，Sequel和Sequel II平臺并投入使用（Table 1）。2005年，英國牛津納米孔技術(shù)公司

圖2 三代PacBio測序原理

Oxford Nanopore ?Technologies(ONT)創(chuàng )立了單分子納米孔測序，其主要原理是當單鏈DNA/RNA分子的核酸堿基蛋白納米孔時(shí)（固定在鹽溶液浸沒(méi)膜上的蛋白質(zhì)納米孔，固定膜上施加了固定電壓），通過(guò)創(chuàng )新的技術(shù)識別離子電流的微小變化，即：當DNA分子穿過(guò)納米孔時(shí)，相對于每個(gè)核苷酸，都會(huì )獲得不同的電流信號。記錄每個(gè)孔的離子電流變化，并基于馬爾可夫模型或遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的方法將其轉換為堿基序列（圖3）。其優(yōu)勢之一是支持RNA直接測序，除此之外，Ultra-long reads (ULRs) 是ONT平臺的另一重要特征，并具有促進(jìn)大型基因組組裝的潛力。Nanopore測序平臺相繼推出MinION，GridION，PromethION及Flongle平臺并投入使用（Table 2）。

圖3 三代Nanopore測序原理

二、三代長(cháng)讀長(cháng)單分子測序技術(shù)PacBio和Nanopore的比較

PacBio和Nanopore具有共同的優(yōu)點(diǎn)，即長(cháng)讀長(cháng)；同時(shí)也具有共同的缺點(diǎn)即高錯誤率（糾錯前隨機分布的?5–20％堿基錯誤率），隨著(zhù)新測序儀和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，測序平臺的優(yōu)缺點(diǎn)有望發(fā)生改變，無(wú)論是PacBio還是ONT測序平臺都致力于獲得更長(cháng)讀長(cháng)的reads的同時(shí)，兼獲高準確的堿基序列信息。

?

圖4 PacBio與Nanopore測序原理及信號識別原理比較

PacBio CCS高精準測序：早在2017年，研究人員分別利用了PacBio和Nanopore平臺測序進(jìn)行了酵母基因組De novo，進(jìn)一步發(fā)現PacBio測序平臺的準確性略高于Nanopore測序平臺(Giordano et al. 2017)。為了解決PacBio較高錯誤率的問(wèn)題，PacBio已升級了CCS測序模式以獲得長(cháng)讀長(cháng)的高保真（HiFi）15 kb reads，Circular Consensus Sequencing (CCS) read: 環(huán)形一致性序列，這種一致性序列通過(guò)對來(lái)自單個(gè)ZMW中的subreads進(jìn)行比對產(chǎn)生。產(chǎn)生的CCS reads使用CCS算法需要至少三輪讀取來(lái)自插入片段的subreads，單條CCS read準確性可達99%以上（圖5）。Sequel II System 2.0版本試劑雖然使得HiFi文庫的插入片段長(cháng)度提升至15-20 kb，從而更好的支持基因組從頭組裝，但是對于組裝來(lái)說(shuō)，長(cháng)度仍有較大的提升空間。

圖5 PacBio CCS測序原理及準確性評估

Nanopore超長(cháng)讀長(cháng)測序：盡管組裝方法不斷在改進(jìn)，且已開(kāi)發(fā)物理圖譜技術(shù)（光學(xué)圖譜），但讀長(cháng)長(cháng)短仍然是高質(zhì)量動(dòng)植物基因組的限制因素。如植物基因組由于高雜合，及其復雜的多倍性和高重復含量，其組裝仍然具有挑戰性，讀長(cháng)必須超過(guò)基因組中的主要重復序列長(cháng)度，及嵌合的長(cháng)末端重復序列（LTR）或單倍型Blocks，其長(cháng)度可能跨越20–200 kb。雖然PacBio是提供Long Reads（>1 kb）的技術(shù)，且通常 Reads N50長(cháng)度可大于20 kb，但即便是幾乎完美的15 kb reads可能無(wú)法組裝復雜植物基因組中經(jīng)常出現的嵌合及高度相似的重復序列。而ONT測序平臺大大解決了這一問(wèn)題，與PacBio reads平均長(cháng)度項目（圖6），一小部分ONT reads讀長(cháng)超過(guò)300 kb，同時(shí)PacBio不包含任何大于150 kb的reads。許多復雜的植物基因組具有大于20 kb或更長(cháng)的重復序列，所以即便目前ONT具有一定錯誤率，但其大大促進(jìn)了基因組的組裝，從而顯著(zhù)提高了基因組連續性或完整性。例如：使用ONT測序更新的擬南芥Col-0基因組最終通過(guò)組裝，減少到40個(gè)Contigs，且跨越了染色體臂（端粒到著(zhù)絲粒），同時(shí)解決了前期在TAIR10參考基因組中存在的gaps及組裝錯誤(Jupe et al. 2020)。

圖6 三代Nanopore和PacBio測序讀長(cháng)比較

三、百邁客雙平臺(Nanopore+PacBio）動(dòng)植物基因組De novo研究策略—魚(yú)和熊掌可兼得

“魚(yú)，我所欲也，熊掌亦我所欲也；二者不可得兼，舍魚(yú)而取熊掌者也。正如在動(dòng)植物基因組研究中，針對基因組組裝，為了兼顧長(cháng)讀長(cháng)的同時(shí)，獲得高準確性的物種基因組密碼信息，在選擇測序技術(shù)選擇(PacBio or Nanopore?)上總會(huì )有魚(yú)和熊掌不可兼得的感覺(jué)。長(cháng)久以來(lái)，百邁客一直致力于成為“專(zhuān)業(yè)的基因組組裝專(zhuān)家”，擁有雙平臺的基礎上（2015年首次引進(jìn)PacBio平臺；2017年首次引進(jìn)Nanopore平臺），力求整合雙平臺各自的優(yōu)勢，著(zhù)力于開(kāi)發(fā)各種軟件、算法，為每個(gè)物種提供訂制的“基因組套餐”，即打造高質(zhì)量，高完整性的物種基因組。從本章節起，小編后續會(huì )結合新的技術(shù)策略、測試數據及文章案例，為大家帶來(lái)全新的基因組研究策略，旨在獲得高度連續性基因組的前提下，同時(shí)完成高準確性動(dòng)植物基因組密碼的破譯，即魚(yú)與熊掌可兼得。

首先通過(guò)百邁客三代Nanopore和PacBio平臺相關(guān)物種測序讀長(cháng)（表1）及組裝結果的比較（表2），進(jìn)一步通過(guò)我們的實(shí)際案例來(lái)看一下Nanopore測序平臺在基因組組裝中的優(yōu)勢。

表1 Nanopore與PacBio平臺實(shí)測物種數據讀長(cháng)比較

通過(guò)雙平臺實(shí)測數據的比較分析: Nanopore平臺平均讀長(cháng)為28.5 Kb左右，Reads N50平均讀長(cháng) 38Kb左右；PacBio CLR平均讀長(cháng)20 Kb左右，Reads N50平均讀長(cháng) 28Kb左右；CCS平均讀長(cháng)12-15 Kb，Reads N50 16~18Kb，發(fā)現Nanopore比PacBio平臺讀長(cháng)高10 Kb左右，而PacBio CCS模式讀長(cháng)遠低于CLR模式。

同時(shí)通過(guò)PacBio和Nanopore雙平臺測序數據組裝結果的比較發(fā)現，利用PacBio數據進(jìn)行基因組組裝Contig N50一般達到Mb級別，而利用Nanopore數據進(jìn)行基因組組裝，Contig N50指標平均水平基本能再提升2倍或者更高，甚至許多物種能達到幾十Mb（如百邁客利用Nanopore測序平臺組裝的水產(chǎn)動(dòng)物綠鰭馬面鲀基因組，Contig N50高達22 Mb）。

表2?Nanopore與PacBio平臺實(shí)測物種組裝指標比較

由于Nanopore測序Reads讀長(cháng)長(cháng)，PacBio Sequel II HiFi模式測序準確性高達99%以上，為了同時(shí)利用其雙平臺各自的優(yōu)勢，我們擬通過(guò)Nanopore測序數據對某多倍體植物進(jìn)行基因組組裝，同時(shí)通過(guò)低深度PacBio CCS數據進(jìn)行Polish，進(jìn)而對該多倍體植物基因組連續性，完整性及準確性進(jìn)行評估，以獲得高連續性，高準確的基因組密碼信息，測試結果如下：

1. 某多倍體植物組裝基本信息

2.?采用不同深度下的PacBio CCS數據進(jìn)行Polish，然后利用真核有胚植物數據庫對不同深度PB CCS Polish的結果進(jìn)行BUSCO完整性評估，以獲得最佳的CCS數據矯正深度，分析結果如下：

分別利用5x，10x，15x和20x的PacBio CCS數據進(jìn)行Polish，發(fā)現當利用10xCCS數據進(jìn)行Polish后，隨著(zhù)CCS數據深度的增加（15x，20x），BUSCO完整性比率無(wú)進(jìn)一步提升，基本在97.43%左右，通過(guò)CCS數據矯正的梯度設置，進(jìn)一步證明了10x PacBio CCS數據足以保證基因組完整性評估。

3.?采用不同測序平臺數據對Nanopore原始組裝結果進(jìn)行Polish，進(jìn)而利用真核有胚植物數據庫進(jìn)行BUSCO完整性評估，完整性比對結果如下：

通過(guò)比較Nanopore數據原始組裝、Nanopore Polish、Nanopore Polish+二代Polish及PacBio CCS Polish后基因組的完整性，發(fā)現基因組的BUSCO完整性比例逐漸升高，分別為：77.01%，93.96%，95.28%和97.43%，當利用10 x PacBio CCS數據Polish后，BUSCO完整性比例最高，約為97.43%，說(shuō)明了前期推測的準確性，即可利用高深度的Nanopore數據進(jìn)行組裝以提升基因組組裝指標，進(jìn)而利用低深度的PacBio CCS數據提升基因組完整性。

4.?不同深度CCS 數據Polish后二代數據回比結果

利用5x，10x，15x和20x的PacBio CCS數據對基因組進(jìn)行Polish，然后利用50x的二代數據回比到基因組上，最后發(fā)現回比率相當，雙端比對效率97%左右。

5.?通過(guò)將20?x?CCS數據分別回比到10 x PacBio CCS polish及100 x Nanopore+50 x Illumina Polish后基因組，截取基因組上特性區域，進(jìn)行組裝基因組單堿基準確性的比對與評估，發(fā)現10?x?PacBio CCS polish后的結果提升效果明顯，我們挑選了幾個(gè)實(shí)例如下：

區域1：

PacBio CCS回比結果（10x CCS Polish基因組）

PacBio CCS回比結果（100 x ONT+50 x Illumina Polish基因組）

區域2：

PacBio CCS回比結果（10x CCS Polish基因組）

PacBio CCS回比結果（100x Nanopore+50x Illumina Polish基因組）

上述分析結果中，進(jìn)一步證實(shí)了前期的推測，利用Nanopore超長(cháng)讀長(cháng)的優(yōu)勢，組裝獲得高連續性基因組（Contig N50 約10 Mb），同時(shí)結合PacBio CCS高準確性測序，進(jìn)一步提升基因組中單堿基的準確度，即魚(yú)和熊掌可兼得。高連續性基因組的獲得，對后續功能基因定位，結構變異檢測具有重要的意義；同時(shí)高準確的基因組的獲得，對于超大基因組，多倍體基因組等復雜基因組的LTR的熱點(diǎn)區域的研究更具突破性的意義。除此之外。在很多動(dòng)植物基因組上的確存在高度復雜的區域，即使通過(guò)高深度PacBio?CCS數據依然無(wú)法矯正，這就需要通過(guò)其它相應的技術(shù)及軟件參數整合來(lái)提升基因組的準確性。

四、雙平臺(Nanopore+PacBio）基因組De novo高分文章賞析

文章案例1：同源多倍體紫花苜?；蚪M

期刊：Nature Communications

發(fā)表時(shí)間：2020年5月

基因組De novo策略：PacBio CCS+ONT+ALLHiC

在對同源四倍體紫花苜蓿（Medicago sativa?L.）基因研究中，首先利用了70 GB，~22x PacBio CCS數據進(jìn)行基因組組裝，組裝獲得紫花苜?；蚪M大小3154 Mb，Contig N50=459 kb, 然后利用ALLHiC進(jìn)行同源染色體組群的劃分，最后通過(guò)Hi-C互作熱圖、遺傳圖譜共線(xiàn)性、ONT數據回比、BUSCO完整性、轉錄組對基因組完整性等進(jìn)行評估，值得注意的是在ONT數據回比評估中（Table 3)，文中篩選了99 GB ONT long reads中的最長(cháng)200條reads（ranged from 95 to 263 Kb）進(jìn)行回比，發(fā)現89%的的reads都能比對到single染色體上，結合其它評估方法，進(jìn)一步說(shuō)明了組裝及染色體位置的準確性。

文章案例2：小墊柳基因組

期刊：Nature Communications

發(fā)表時(shí)間：2019年11月

基因組De novo策略：ONT+PacBio +HiC

在小墊柳（Cushion willow）基因組組裝中，首先利用SMARTdenovo對糾錯后的74xONT數據進(jìn)行組裝，然后分別利用125xPacBio數據(two rounds )與Illumina數據(five rounds )進(jìn)行polish，基因組完整性評估后，利用Hi-C將Contig掛載到染色體水平，最終組裝獲得小墊柳基因組大小339.588 Mb，Contig N50=9.522 Mb。?(Table 4)

五、百邁客Nanopore、PacBio平臺動(dòng)植物基因組合作文章總覽(部分）

北京百邁客生物科技有限公司自2015年引入Pacbio測序平臺，2017年初引入Nanopore測序平臺以來(lái)，截止到目前百邁客已擁PacBio平臺：RS Ⅱ、PacBio Sequel、PacBio sequel Ⅱ；Nanopore 平臺：PromethION-48、PromethION-β、Nanopore GridION、MinION，擁有主流三代測序儀，尤其針對復雜超大基因組測序，百邁客生物具有三代測序通量，以滿(mǎn)足超大基因組的組裝需求。同時(shí)PacBio和Nanopore兩大主流三代測序平臺各自及組合經(jīng)驗，為老師們提供了可參考且全面優(yōu)質(zhì)的選擇！選擇我們，提供專(zhuān)屬于您基因組套餐！

百邁客現提供測序分析+分子試劑一站式解決方案：基因表達量驗證：反轉試劑盒+qPCR試劑盒；SNP驗證：PCR Mix；克隆驗證：PCR Mix+無(wú)縫克??；DNA、RNA提取試劑盒解決疑難物種提取。期待與您的合作?。?！

參考文獻：

1.?Midha, M. K.?et al. Long-read sequencing in deciphering human genetics to a greater depth.?Human Genetics(2019).

2.?Michael, T. P.?et al. Building near-complete plant genomes.?Current Opinion in Plant Biology(2020).

3.?Goodwin, S.?et al. Coming of age: ten years of nextgeneration sequencing technologies.?Nature Reviews?|Genetics(2016).

4.?Chen, H.?et al. Allele-aware chromosome-level genome assembly and efficient transgene-free genome editing for the autotetraploid cultivated alfalfa.?Nature Communications(2020).

5.?Chen, J. H.?et al. Genome-wide analysis of Cushion willow provides insights into alpine plant divergence in a biodiversity hotspot.?Nature Communications(2019).