篤~篤~篤……，2018年QTL/基因定位12連發(fā)~~

12篇QTL定位相關(guān)的SCI文章“橫空出世”了～～～

在這里，小編必須要恭賀各位老師們在新年伊始取得了“開(kāi)門(mén)紅！

來(lái)來(lái)來(lái)，咱往下看↓
（文末繼續有中標的國自然標書(shū)分享~）

本期，為大家解讀通過(guò)SLAF-BSA對小麥抗病性進(jìn)行基因定位的文章，一起來(lái)看一下長(cháng)江大學(xué)馬東方副教授和朱永興講師在《Scientific Reports》上發(fā)表的“利用SLAF-BSA快速鑒定小麥空間輻射突變體中抗條紋病基因”。

1.研究背景

普通小麥是主要的糧食作物之一，但由于小麥條銹病菌的侵害，使得小麥產(chǎn)量逐年降低，尤其是在西南和西北地區。條銹病抗性分為全生育期抗性（ASR，包括幼苗和成株）和成株抗性（APR），前者通常是單個(gè)主效基因控制的，是傾向于針對某一特定菌種而產(chǎn)生的抗性，而后者的抗性則不針對某一特定菌種且為數量遺傳，其保護水平通常是不完全的，并受生長(cháng)階段，溫度，濕度和接種量的影響。因此，定位這兩種小麥抗條銹病抗性基因是當務(wù)之急。

2.材料與方法

01.材料
親本：銘賢169（Mingxian 169）×R39，銘賢169為感病栽培種；R39為抗性品種，是鄭麥9023（zhengmai 9023）突變體材料自交8代所形成
群體類(lèi)型：F2群體
混池規模：45+45
其他材料：F1、BC1和鄭麥9023

02.實(shí)驗處理
在可溫控的溫室內，利用7個(gè)條銹病菌 (CYR29, CYR30, CYR31, CYR32, CYR33, Su11-4 和 Su11-11)的新鮮夏孢子對雙親、F1、BC1，F2和鄭麥9023的完全展開(kāi)的第一片子葉進(jìn)行侵染。
幼苗試驗處理：先在10°C的培養室內培養24h，然后移置溫室，在環(huán)境變化的條件下培養（循環(huán)方式：18°C下，光照16h；10°C下，黑暗8h）；
成株試驗處理；將發(fā)芽幼苗在4℃冰箱中春化5周，然后移栽到盆中溫室生長(cháng)。
1個(gè)月后，孕穗期的親本和后代接種混合有滑石的夏孢子（urediniospore）并如上所述溫育，接種18-20d記錄侵染類(lèi)型（IT），并按前人劃分標準分為0-4。IT 0至2+的認為具有抗性，而IT3至4的則認為是易感的。
收集種子測量千粒重（TSW）。每個(gè)栽培品種三個(gè)生物學(xué)重復。

03.技術(shù)手段
1）SLAF-seq+BSA：銘賢169、R39、感病混池和抗病混池（混池材料各45個(gè)），計算方法：SNP-index和ED；
2）SSR-遺傳圖譜：銘賢169、R39、高感病混池和高抗病混池（混池材料各10個(gè)，來(lái)自上述測過(guò)序的材料）（互為驗證）；
3）qRT-PCR：每次實(shí)驗做了三個(gè)生物學(xué)重復，每個(gè)重復兩次技術(shù)性重復。

3.實(shí)驗結果

01.小麥突變體R39具有成株抗性
在抗性鑒定中發(fā)現，其在幼苗期對7種病菌均呈現感病，而成株期均呈現抗?。▓D1a）；而鄭麥9023和銘賢169全生育期均為感病。此外，R39的千粒重顯著(zhù)高于鄭麥9023和銘賢169，這表明在條銹病發(fā)病條件下，R39的籽粒產(chǎn)量更高，種子質(zhì)量更好（圖1b-d）。

圖1 抗性和產(chǎn)量評價(jià)

02.針對CYR33菌種，R39 的APR由一個(gè)隱性基因控制
如表1，F2群體分離比是3:1，所以CYR33的R39 的APR由一個(gè)隱性基因控制。這個(gè)抗病基因命名為YrR39。在R39、抗性F2和抗性BC1材料中一個(gè)顯著(zhù)特征是葉斑點(diǎn)。而且上述兩個(gè)特征在未接種的群體內也是一樣的。

表1 親本及分離群體抗病和感病頻率統計

03.SLAF-seq+BSA的分析結果
利用SNP-index和ED兩種算法，將抗病基因YrR39定位在4B染色體上17.39 Mb的區域內。（這里就不細說(shuō)了，直接上圖）

圖2 BSA分析的兩種方法的結果

04.利用SSR標記驗證目標區域
4B染色體上有83對SSR是有多態(tài)性的，但是其中只有8對能清楚的區分雙親及兩個(gè)混池。利用其對462個(gè)F2個(gè)體進(jìn)行基因分型并構建遺傳圖譜，將YrR39定位于染色體4BL 的2.6cM的區間內，其側翼標記為Xwmc495和Xwmc48（如圖3）。這與BSA分析結果一致，也驗證了SLAF-seq檢測結果的準確性。

圖3? 染色體4BL的連鎖圖譜

05.條銹菌感染對候選基因表達的影響
目標區域包含126個(gè)基因（表3），通過(guò)功能注釋?zhuān)业?1個(gè)與條銹病抗性相關(guān)的基因，擬定為候選基因，并進(jìn)行qRT-PCR驗證。結果表明，在病菌接種后12、24、48和96h，只有候選基因Traes_4BS_C868349E1（注釋為F-box / LRR-重復蛋白）在R39中顯示出比在銘賢169中更高的表達水平（圖4）。 這表明其可能參與了R39對條銹病的抗性。

表3 關(guān)聯(lián)區域內結果

圖4? 21個(gè)候選基因的qRT-PCR結果

借鑒之處

1. 表型鑒定的方法是基于前人的方法，且將突變的原始材料鄭麥9023作為對照，增加結果的可靠性；
2. 利用SSR圖譜和測序結果互相驗證，確保結果可靠；
3. 找到區間，然后看功能注釋找候選基因，對候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗證（也可用RNA-seq來(lái)驗證）
4. 研究斑點(diǎn)性狀這個(gè)病癥與抗性的關(guān)系，這一點(diǎn)來(lái)源于細心的觀(guān)察和不斷的思考（思考什么呢？你懂得~~）；
5. 作者仍在繼續驗證這個(gè)基因（科研的態(tài)度）。正所謂真金不怕火煉，前面所提幾種方法均可對其驗證，以增加可靠度。

遺傳群體事業(yè)部 小猴子丨文案
許語(yǔ)輝 | 審核
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