細菌16S rRNA基因全長(cháng)約1,550個(gè)堿基對，由8個(gè)高度保守區和9個(gè)高變區(這些區域命名為V1至V9；圖1)組成。在進(jìn)行16S rRNA基因測序研究時(shí)，二代測序由于讀長(cháng)限制，往往使用通用引物擴增一個(gè)或幾個(gè)高變區，而PacBio全長(cháng)16S測序能夠一次獲得V1-V9區9個(gè)高變區序列，從而個(gè)獲得更多信息，在種水平注釋具有重要優(yōu)勢。尤其中在醫學(xué)領(lǐng)域，全長(cháng)16S rRNA基因測序已得到廣泛運用，其中包括人腸道菌群研究、皮膚、鼻腔、母乳、癌組織、宮腔、口腔等。
圖1.16S rRNA基因保守區和可變區的示例圖。
今天給大家分享3篇全長(cháng)微生物多樣性的研究案例，快來(lái)看看吧！
案例一
標題：High-Level Acquisition of Maternal Oral Bacteria in Formula-Fed?Infant Oral Microbiota
譯名：配方奶喂養的嬰兒口腔微生物群中母體口腔細菌的高水平獲取[1]
期刊：mBio?[IF:7.867]
發(fā)表時(shí)間：2022年1月
研究方法：全長(cháng)16S rDNA測序
文章簡(jiǎn)介
背景：母體口腔微生物的大量涌入被認為在嬰兒口腔微生物群的獲得和發(fā)育中起著(zhù)重要作用。
方法：研究者收集了448對母嬰在4個(gè)月體檢時(shí)的舌拭子樣本，運用PacBio的16S rRNA全長(cháng)基因單分子測序和擴增序列變異(ASV)方法研究每個(gè)樣本的細菌組成。
結果：盡管嬰兒口腔微生物區系與母親口腔微生物群明顯不同，但與其親生母親共享的ASV的相對豐度中位數顯著(zhù)高于與非親緣母親共享的ASV。這種共享豐度與嬰兒的喂養方式密切相關(guān)，而不是他們的分娩方式或抗生素暴露，配方奶喂養的嬰兒比純母乳喂養的嬰兒共享豐度更高。該研究提供了口腔細菌母嬰傳播的菌株水平證據，并表明在配方奶喂養的嬰兒中，母親口腔細菌的定殖率更高。
結論：通過(guò)全長(cháng)16S rRNA基因測序和ASV序列分析的方法觀(guān)察到母體口腔微生物群向嬰兒的傳播，配方奶喂養的嬰兒獲得母體口腔細菌的數量明顯較高。此外，區分嬰兒細菌的來(lái)源使嬰兒口腔微生物群的細菌組成評估具有更高的分辨率。這種新的信息和方法可以為進(jìn)一步研究口腔微生物群的發(fā)展奠定基礎，并最終可為建立新的預防和治療策略提供數據，運用于控制口腔微生物群的細菌平衡和致病性。
圖2母嬰對中口腔微生物群的微生物聯(lián)系
(A)?基于BrayCurtis距離的母親和嬰兒樣本的PCoA圖。(B)優(yōu)勢OTU的平均相對豐度和共享指數。(C)母嬰配對(n=448)和無(wú)關(guān)母嬰配對(n=198,464)的Bray-Curtis距離的小提琴曲線(xiàn)圖。(D)每名嬰兒與親生母親(n=448)和與無(wú)親緣關(guān)系的母親(n=198,464)分享的ASV總相對豐度的小提琴曲線(xiàn)圖。(E，F)與Veillonella dispar和?Streptococcus salivarius相對應的ASV的分布。
案例二
標題：Jia Wei Xiao Yao San ameliorates chronic stress-induced depression-like behaviors in mice by regulating the gut microbiome and brain metabolome in relation to purine metabolism
譯名：加味逍遙散通過(guò)調節與嘌呤代謝有關(guān)的腸道微生物組和腦代謝組改善慢性應激誘導的抑郁樣行為[2]
期刊：Phytomedicine??[IF: 5.340]
發(fā)表時(shí)間：2022年1月
研究方法：全長(cháng)16S rDNA測序、非靶向代謝組學(xué)、行為測試、免疫熒光染色、細胞因子的定量等
文章簡(jiǎn)介
背景：抑郁癥的發(fā)病機制很大程度上仍不清楚。越來(lái)越多的證據表明，腸道微生物群組成和腦功能之間存在著(zhù)復雜的關(guān)系。加味逍遙散(JWXYS)被認為是一種潛在的抗抑郁藥物，但其藥理作用機制尚未闡明。該文章探討了加味逍遙散散對慢性應激誘導的小鼠抑郁行為的影響。
方法：建立慢性束縛應激抑郁小鼠模型。給予加味消炎散，通過(guò)多項行為學(xué)測試評價(jià)小鼠對治療的反應。用特異性熒光標記法檢測星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活性；對腸道和腦組織中的炎性細胞因子進(jìn)行定量。采用全長(cháng)16S rRNA測序和非靶向代謝組學(xué)相結合的方法，從物種水平上研究腸道微生物群、代謝腦功能和JWXYS之間的關(guān)系。
結果：發(fā)現行為癥狀與動(dòng)物乳桿菌(?L. animalis)的相對豐度有關(guān)。經(jīng)JWXYS處理后，描述了具有潛在參與嘌呤代謝的酶的Ileibacterium valens菌的相對豐度。星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的激活與動(dòng)物乳桿菌的相對豐度呈負相關(guān)。結合網(wǎng)絡(luò )藥理學(xué)分析，在加味消炎散治療的基礎上預測的幾個(gè)靶點(diǎn)集中在嘌呤代謝上，嘌呤代謝也富含JWXYS調節的腦代謝物。
結論：動(dòng)物乳桿菌參與了小鼠的抑郁樣行為，加味消炎散可增加大腦嘌呤代謝相關(guān)酶的活性，并與杏仁核星形膠質(zhì)細胞的激活呈正相關(guān)。
圖3.(A)不同群體的阿爾法多樣性指數(Chao1、PD_Whole_Tree.、Shannon、Simpson)的變化。(B)不同組樣本的beta多樣性指數(Bray-Curtis，未加權UniFrac)的特征。(C)基于對照組、模型組和JWXYM組之間的Lefse分析，確定腸道微生物組的潛在生物標志物。
案例三
標題：Evaluations and comparisons of microbial diversities in four types of?body fluids based on two 16S rRNA gene sequencing methods
譯名：基于兩種16S rRNA基因測序方法對四種體液微生物多樣性的評價(jià)與比較[3]
期刊：Forensic Science International ?[IF: 2.395]
發(fā)表時(shí)間：2021年11月
研究方法：全長(cháng)16S rDNA測序、二代16S rDNA測序
文章簡(jiǎn)介
背景：體液是犯罪現場(chǎng)常見(jiàn)的生物痕跡之一。了解這些生物痕跡的類(lèi)型可以為法醫案件的調查提供關(guān)鍵線(xiàn)索。近年來(lái)，16S rRNA基因部分高變區測序和全長(cháng)16S rRNA基因測序引起了研究人員的興趣，
方法：采用二代16S rRNA基因V3-V4短讀長(cháng)測序和基于單分子實(shí)時(shí)測序的16S rRNA基因全長(cháng)測序，對唾液、外周血、陰道分泌物和月經(jīng)血中的微生物進(jìn)行分類(lèi)。
結果：短讀長(cháng)測序的α多樣性指數大于全長(cháng)測序。兩個(gè)平臺采集的4種體液中細菌類(lèi)群水平相似，但豐度不同。主坐標分析和分子方差分析結果表明，陰道分泌物和經(jīng)血的微生物組成相似，唾液、外周血、陰道分泌物和經(jīng)血的微生物組成有顯著(zhù)差異。線(xiàn)性判別分析表明，四種體液中篩選出的差異細菌在兩種測序結果中存在差異。兩種測序方法均可用于檢測4種不同體液中的細菌多樣性，為微生物鑒定4種體液提供了潛在的工具，其中全長(cháng)測序能提供更準確的分類(lèi)。
圖4.屬水平上四種體液細菌豐度柱狀圖。
全長(cháng)微生物多樣性研究現狀
根據PubMed檢索結果，我們可以看到運用全長(cháng)微生物多樣性發(fā)表的文章逐年遞增。一方面隨著(zhù)測序技術(shù)也越來(lái)越成熟；另一方面PacBio sequel II通量的提升使得研究成本大幅降低，全球越來(lái)越多的研究學(xué)者開(kāi)始采用全長(cháng)微生物多樣性測序來(lái)進(jìn)行微生物組學(xué)研究。
全長(cháng)微生物多樣性?xún)?yōu)勢一：數據準確性高
PB全長(cháng)多樣性測序基于HIFI模式對單一片段進(jìn)行多輪測序的方式來(lái)提升準確性。由于PacBio的原始錯誤為隨機錯誤，可通過(guò)獲取CCS（Circular Consensus Sequencing）進(jìn)行自身糾正來(lái)提升數據的準確性。
細菌16S全長(cháng)約1.5Kb，目前PacBio Sequel II測序平臺平均酶讀長(cháng)可以達到70 Kb，當測序酶讀長(cháng)達到?8Kb時(shí)，就可以滿(mǎn)足一條1.5Kb的16S全長(cháng)糾錯5次，同一片段測序?5?次后，單一Read的準確性至少達到Q20（99%）
全長(cháng)微生物多樣性?xún)?yōu)勢二：種水平注釋率高
運用三代測序，可以輕松跨越V1-V9區，進(jìn)而獲得全長(cháng)序列，序列中攜帶的特征信息更多，可以支持“種”水平的分辨率，在文章撰寫(xiě)中可在種水平進(jìn)行深入挖掘和討論，尤其是在biomarker的尋找。常規樣本平均種水平注釋率可達60%。
百邁客微生物數據實(shí)測
全長(cháng)微生物多樣性?xún)?yōu)勢三：群落結構更準
不同物種不同高變區的變異程度不同，部分高變區研究可能?chē)乐氐凸阑蛘吒吖廊郝渲形⑸锏亩鄻有?，不同高變區短讀長(cháng)擴增子的PCR引物選擇會(huì )影響推斷的群落準確性和某些細菌類(lèi)群的敏感性，使得微生物組研究很難在全局水平上進(jìn)行比較；全長(cháng)微生物多樣性一次獲得全部保守區和高變區序列，能夠精準還原微生物群落結構。
橫軸表示物種，縱軸表示豐度，黑色柱子表示全長(cháng)16S鑒定準確而V4區測序失真；白色柱子表示V4區鑒定準確而全長(cháng)16S結果失真，對比可以看出，全長(cháng)16S的覆蓋度和準確度更高。E Singer et al.?ISME J
不同物種不同高變區的變異程度,物種多樣性被低估或者高估
如果您對全長(cháng)微生物多樣性測序技術(shù)感興趣，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費為您設計文章研究思路方案。
[1]Kageyama S, Furuta M, Takeshita T, et al. High-Level Acquisition of Maternal Oral Bacteria in Formula-Fed Infant Oral Microbiota[J]. Mbio, 2022, 13(1): e03452-21.
[2]Ji S, Han S, Yu L, et al. Jia Wei Xiao Yao San Ameliorates Chronic Stress-Induced Depression-Like Behaviors in Mice by Regulating the Gut Microbiome and Brain Metabolome in Relation to Purine Metabolism[J]. Phytomedicine, 2022: 153940.
[3]Mei S, Zhao M, Liu Y, et al. Evaluations and comparisons of microbial diversities in four types of body fluids based on two 16S rRNA gene sequencing methods[J]. Forensic Science International, 2022, 331: 111128.
京公網(wǎng)安備 11011302003368號