Bulked Segregant Analysis（BSA）分析是利用極端性狀個(gè)體混池快速進(jìn)行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應用在植物基因克隆方面。SLAF-seq是百邁客自主研發(fā)的簡(jiǎn)化基因組測序技術(shù)，通過(guò)對基因組特定的酶切片段進(jìn)行高通量測序，在降低基因組復雜度的基礎上，又獲得大量的基因組變異信息，在群體遺傳研究中發(fā)揮著(zhù)重要作用。將SLAF-seq和BSA分析完美結合（SLAF-BSA）進(jìn)行功能基因定位，是一種快速、準確、性?xún)r(jià)比極高的分析策略。日前，由百邁客和揚州大學(xué)陳學(xué)好教授課題組合作，利用SLAF-BSA策略定位黃瓜耐淹基因，相關(guān)研究成果發(fā)表于新一期的Plant Journal雜志。本期圖譜君將對這一成果解讀，同時(shí)文末繼續有基于遺傳群體進(jìn)行基因定位的國自然標書(shū)，期待能給大家3月份的國自然基金申請帶來(lái)一些靈感。
英文標題：The major-effect QTL CsARN6.1 encodes an AAA-ATPase domain-containing protein that is associated with waterlogging stress tolerance through promoting adventitious root formation
中文標題：CsARN6.1編碼的AAA-ATPase基因通過(guò)促進(jìn)不定根形成增強黃瓜耐水淹性
發(fā)表期刊：the Plant Journal， 2018
影響因子：5.90
背景
高等植物需要一定量的氧氣來(lái)保持代謝和生長(cháng)，然而在水淹狀態(tài)下，土壤中氧含量比正常情況下低320,000倍，植物根系可利用氧氣含量降低，進(jìn)而影響植物根系的很多生長(cháng)和代謝生理過(guò)程。水淹情況下，大量有害物質(zhì)積累也會(huì )造成對植物的毒害作用。以上變化將嚴重影響植物生長(cháng)、干物質(zhì)積累以及植物最終的產(chǎn)量。所以，分離植物耐水淹基因、揭示耐水淹分子機制、開(kāi)展耐水淹品種選育具有重要意義。
黃瓜是重要的蔬菜品種，其根生長(cháng)淺，對氧氣需求較為嚴格，這造成它對水淹脅迫非常敏感。在水淹脅迫下，黃瓜下胚軸通過(guò)產(chǎn)生不定根來(lái)獲取氧氣，以適應水淹脅迫。為解析水淹脅迫下黃瓜不定根生產(chǎn)現象的遺傳學(xué)機制，研究者曾利用耐水淹材料Zaoer-N 和不耐水淹材料Pepino構建的群體進(jìn)行QTL定位，已經(jīng)分離了一個(gè)控制不定根數目的主效QTL ARN6.1，該QTL在多年的實(shí)驗均解釋了較高的表型貢獻率。本研究將對該QTL進(jìn)行精細定位，確定引起性狀差異的基因，并進(jìn)行多方面的驗證。
材料方法
主要結果
1.不定根數目是數量性狀且與水淹脅迫耐受力顯著(zhù)相關(guān)
表型觀(guān)察發(fā)現，水淹處理7天后，Zaoer-N幼苗下胚軸生長(cháng)出許多不定根，而Pepino幾乎沒(méi)有（圖1）；通過(guò)對F2群體表型統計，所有子代的不定根數目表現出正態(tài)分布，這也說(shuō)明了該性狀為數量性狀（圖2）。另外，對F2群體的949個(gè)個(gè)體進(jìn)行水淹耐受力評估打分，發(fā)現不定根數目與水淹耐受力之間呈顯著(zhù)正相關(guān)，皮爾森相關(guān)系數為0.72（P = 0.05），這表明不定根數目可以作為衡量水淹耐受力的可靠指標。
圖1 Zaoer-N和Pepino不定根生長(cháng)情況
圖2 F2群體不定根數目分布統計
2、ARN6.1的初定位
利用SLAF-seq的方法對親本及兩個(gè)極端混池進(jìn)行測序，親本測序深度分別為29.18×和22.85×，兩個(gè)混池的深度分別為50.6×和53.72×，以9930為參考基因組，利用△SNP-index和ED的方法計算顯著(zhù)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，將關(guān)聯(lián)區域定位在6號染色體標記SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096之間，區間大小301kb（圖3）。
圖3 BSA定位結果
3、ARN6.1的精細定位
利用定位區間側翼SLAF標記（SLAF_marker_192310和SLAF_marker_192096）上的SNP，分別各開(kāi)發(fā)KASP標記（KASP1和KASP13），并對2274個(gè)F2子代進(jìn)行分型，獲得33個(gè)重組個(gè)體；再在KASP1和KASP13之間開(kāi)發(fā)11個(gè)KASP標記，對33個(gè)重組個(gè)體進(jìn)行基因分型，共得到8種單倍型。結合重組個(gè)體基因分型和表型數據，將ARN6.1定位到61.5kb的區間（KASP10和KASP11）（圖4a）。為進(jìn)一步縮小區間，利用KASP10和KASP11對4417個(gè)F2個(gè)體進(jìn)行分型，得到6個(gè)重組個(gè)體，這6個(gè)重組個(gè)體分別自交得到6個(gè)F2:3家系，然后利用新開(kāi)發(fā)的5個(gè)dCAPS對F2:3家系進(jìn)行分型，結合所有表型數據，最終將ARN6.1定位在36.1kb的范圍內（圖4b）。對該區進(jìn)行注釋?zhuān)灿?個(gè)基因（圖4c），有趣的是，其中5個(gè)基因都被預測為編碼AAA 型的ATP酶家族蛋白。
圖4? ARN6.1精細定位過(guò)程
2個(gè)親本重測序分析，在36.1kb的區間內開(kāi)發(fā)到25個(gè)SNP，為確定哪個(gè)SNP與性狀真實(shí)相關(guān)，研究者對100個(gè)黃瓜自交系的23個(gè)SNP（2個(gè)SNP只存在于Zaoer-N中而被過(guò)濾掉）進(jìn)行分型，結合每個(gè)自交系不定根數目的表型數據進(jìn)行局部關(guān)聯(lián)分析，結果顯示SNP02與表型有較強的關(guān)聯(lián)性。對SNP02分析發(fā)現，其位于Csa6G504460的第二外顯子，可能就是引起變異的SNP位點(diǎn)（圖5a）。
圖5 Csa6G504460的分離及表達量分析
4、表達分析驗證Csa6G504460
前期研究中，研究者對親本Zaoer-N和Pepino幼苗下胚軸在水淹處理后進(jìn)行轉錄組分析，以上定位區間內的7個(gè)基因只有Csa6G504460在處理組和對照組間存在差異表達，并且差異表達只發(fā)生在Zaoer-N中（圖5b）。而后，研究者對這7個(gè)基因又進(jìn)行qRT-PCR分析，同樣發(fā)現只有Csa6G504460在Zaoer-N的處理組和對照組間存在差異表達，并且在處理后36h表達量差異出現峰值（圖5c）。另外，組織特異表達分析表明Csa6G504460在多個(gè)組織中均有表達，但是在根中的表達量顯著(zhù)高于其他組織。因此，從基因表達角度驗證了Csa6G504460（以下命名為CsARN6.1）的真實(shí)性。
5、CsARN6.1突變體降低ATP酶活性
基因組和cDNA序列分析顯示，CsARN6.1擁有2個(gè)外顯子，被預測為編碼含有511個(gè)氨基酸殘基的AAA-ATPase結構域蛋白，該蛋白中含有一個(gè)coiled-coil結構域（圖6），前期關(guān)聯(lián)到的SNP02即位于該結構域，由于該SNP的突變導致Asp被替換成Gly，Zaoer-N為CsARN6.1^Asp型，表現出較強的ATP酶活性，而Pepino為CsARN6.1^Gly型，幾乎沒(méi)有ATP活性（圖7）。
圖6 AAA-ATPase基因結構?
圖7 CsARN6.1^Asp和CsARN6.1^Gly蛋白活性比較
6、轉基因驗證
為驗證CsARN6.1的功能，將CsARN6.1^Asp轉入擬南芥中，發(fā)現轉基因植株的根長(cháng)顯著(zhù)長(cháng)于對照，同時(shí)，轉基因植株上可以明顯觀(guān)察到側根發(fā)育，而對照組則沒(méi)有側根發(fā)育（圖8）。為進(jìn)一步驗證，研究者將CsARN6.1^Asp轉入黃瓜品種Xintaimici（CsARN6.1^Gly型），并經(jīng)多代自交和篩選，獲得單拷貝的純合轉基因植株。發(fā)芽后3天，轉基因植株的初生根長(cháng)度顯著(zhù)長(cháng)于野生型。水淹處理后，轉基因黃瓜下胚軸中CsARN6.1的表達量顯著(zhù)高于野生型。處理后7天，轉基因黃瓜下胚軸的不定根數目明顯高于野生型（圖9 e.f.g.h）。另外，野生型黃瓜葉片和子葉的萎黃病較轉基因黃瓜嚴重。以上轉基因結果證實(shí)CsARN6.1能夠促進(jìn)不定根形成和黃瓜水淹耐受力（圖9 i.j）。
圖8 轉基因擬南芥與野生型表型比較?
圖9 轉基因黃瓜與野生型表型比較?
7、ATP酶活性影響黃瓜不定根形成
前期研究發(fā)現，EDTA能夠抑制AAA-ATPase蛋白的ATP酶活性。研究者通過(guò)體外實(shí)驗發(fā)現，經(jīng)EDTA處理的CsARN6.1^Asp蛋白的ATP酶活性相對于對照降低24%（圖10 a）。隨后，研究者用加入EDTA的水處Zaoer-N幼苗，以檢測ATP酶活性損耗對下胚軸不定根的影響。結果發(fā)現，經(jīng)EDTA處理后，Zaoer-N沒(méi)有了不定根生成能力（圖10 b.c）。
進(jìn)化樹(shù)分析顯示，CsARN6.1與擬南芥At2G18190和At3G50930存在較高的同源性（圖10d），而在之前研究中發(fā)現，H2O2處理擬南芥后，At2G18190.1和At3G50930.1被顯著(zhù)誘導表達。水淹后植物體內H2O2積累是普遍的生理響應。因而研究者嘗試在水中加入H2O2后處理Zaoer-N幼苗，與無(wú)水處理的對照相比，48h后處理組植株CsARN6.1的表達量是對照組的4.3倍，與不加H2O2的水處理的對照相比，48h后CsARN6.1的表達量是對照組的2.1倍（圖10 e）。5天后統計不同處理的材料下胚軸不定根數目，發(fā)現與不加H2O2的水處理的對照相比，水中加入H2O2的處理組的不定根數目增加60%（圖10 f.g）。
圖10 EDTA及H2O2處理對ATP酶和黃瓜生根的影響
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