Hi-C輔助基因組組裝

案例一

三代+光學(xué)+HIC拯救復雜基因組—-大麥基因組Nature篇。新鮮出爐的消息，新版大麥基因組又發(fā)nature啦！大麥基因組到底經(jīng)歷了怎樣的困局？到底是什么解救了大麥基因組？后續大麥基因組還會(huì )發(fā)Nature嗎？重復序列比例過(guò)高如何解決？新技術(shù)的到來(lái)更新基因組的必要性到底如何？

大麥基因組的困局：

大麥作為重要的經(jīng)濟作物，其在農業(yè)上的重要性毋需本編過(guò)多描述。大麥基因組破解工作本處于第一梯隊，為何初版基因組在2012年才發(fā)布呢？原因就是大麥基因組的屬于高重復的復雜基因組，通過(guò)當前技術(shù)是無(wú)法很好解決的。雖然只有7條染色體，但是基因組的重復序列比例高達84%，同時(shí)基因組大小在5.1 Gb，相比于人，水稻等簡(jiǎn)單基因組，技術(shù)上存在很大的難度。和人類(lèi)基因計劃一樣，通過(guò)集齊全世界科學(xué)家的努力，構建了大量的BAC文庫，得到了物理圖，同時(shí)基于遺傳圖譜，得到了初版基因組。雖然通過(guò)綜合各種技術(shù)，得到的了基因組序列在4Gb 左右，但其可靠性，準確性難以保障。就拿二代數據來(lái)說(shuō)，當時(shí)只組裝出了1.9 Gb contig的序列，指標更是無(wú)從說(shuō)起。雖然全世界科學(xué)家的努力不可否認也不容質(zhì)疑，但現在看來(lái)，初版大麥基因組給人的感覺(jué)只能是有勝于無(wú)！

到底是什么解救了大麥基因組？廢話(huà)不多說(shuō)，看看人家的組裝結果（表1）。

文章中使用的技術(shù)手段包括BAC+Illumina+BioNano+HiC+Genetic Map，得到了4.79 Gb基因組序列，最終利用HIC和遺傳圖分別將95%和97%的序列掛到了染色體的水平。相比于初版基因組，組裝水平高了不只是一大截啊，這就是技術(shù)上的勝利！話(huà)說(shuō)，基于此版基因組，預測出的基因編碼區至占到了整個(gè)基因組的1.4%，而轉座原件（重復序列的一個(gè)大類(lèi)）卻占到了整個(gè)基因組的80.8%。所以說(shuō)，大麥基因組的難度的確大??！請看文章中描述的組裝技術(shù)路線(xiàn)：

• 構建87085個(gè)BAC，利用Hiseq 進(jìn)行PE及MP文庫測序得到4.5 Tb二代數據，之后將每個(gè)BAC的測序數據分別進(jìn)行組裝；
• 通過(guò)物理圖譜將BAC間的關(guān)系確定；
• 利用遺傳圖+光學(xué)圖譜，通過(guò)組裝好的BAC序列構建Superscaffold；
• 利用群體遺傳圖（POPSEQ）進(jìn)行Superscaffold分組（97%分組）；
• 利用HiC進(jìn)行Superscafold排序及定向（95%掛載）；
• 基因組評估+基因預測+后續分析。

文章中做了哪些分析？

1、染色體間外大小臂之間的交互

通過(guò)HIC熱圖作者發(fā)現無(wú)論是染色體內部還是染色體間的長(cháng)短臂之間都存在較強的交互信號。按照HIC的原理來(lái)說(shuō)，染色體上空間作用越強則實(shí)際DNA間的物理距離越近，染色體大小臂及不同染色體間的相互作用應該是極弱的。為了找出原因，作者通過(guò)對大麥葉核間期的細胞進(jìn)行著(zhù)絲粒及端粒熒光雜交，發(fā)現所有染色體的端粒和著(zhù)絲粒在空間上的位置都純在極性，且排列方式也極其相似，不同染色體間的大小臂其實(shí)在空間上距離很近，因此確實(shí)存在染色體內外大小臂之間大量的交互作用的可能。

2、染色體上重復序列及基因密度

利用染色體位置信息，通過(guò)對20-mer頻率將染色體進(jìn)行劃分成了三種區域，每種區域上在基因密度，重組率，LTR插入時(shí)間以及GC含量上都存在一定的規律。

3、基因家族分析

通過(guò)對大麥基因組進(jìn)行基因家族收縮擴張分析發(fā)現，收縮擴張的家族中*顯著(zhù)的部分都與植物防御及抗病相關(guān)。另外，作者對麥芽品質(zhì)相關(guān)的amy家族及糖代謝相關(guān)的SWEET家族進(jìn)行了亞家族分類(lèi)，多倍化及表達模式相關(guān)的分析。

4、遺傳多樣性及單體型分析

基因組在分子遺傳育種中具有極其重要的作用，本文中作者對來(lái)自歐洲的冬季及春季小麥兩個(gè)群體進(jìn)行了遺傳多樣性及單體型相關(guān)分析。最終發(fā)現，這兩個(gè)群體在不同的染色體位置上的多樣性程度及連鎖強度都存在不同特點(diǎn)。如果沒(méi)有一個(gè)好的基因組，很難全面了解群體間的變異情況，會(huì )給功能育種上帶來(lái)困難。

大麥基因組還能發(fā)Nature嗎？重復序列比例過(guò)高如何解決？

雖然此版基因組已經(jīng)發(fā)表，但是本編覺(jué)得就目前的技術(shù)而言，大麥基因組還是有很大的提升空間。有咩有發(fā)現，此版大麥基因組沒(méi)有使用當前主流基因組所使用的三代測序技術(shù)？雖然此版本基因組相較于第一版基因組提升較大，但是基因組裝的過(guò)于零碎仍舊是事實(shí)。畢竟此版基因組的contigN50才79Kb，而super scaffold N50也才1.9Mb。一旦過(guò)于零碎，肯定會(huì )導致許多基因無(wú)法被預測出，這將對后續基因組的功能解讀及研究增加困難。目前，三代測序技術(shù)在基因組完整性上能夠有很好的發(fā)揮，同時(shí)在基因組結構變異上也能夠有所保障。針對大麥基因組，已經(jīng)有了如此多的數據，本編認為，如果后續如果再加入純三代測序數據，contigN50達到Mb級別是極其輕松的！

案例二

Chromosome-scale assembly of the Sparassis latifolia genome obtained using long-read and Hi-C sequnencing

發(fā)表時(shí)間：2021

合作單位：福建農業(yè)科學(xué)院

發(fā)表期刊：G3（Genes|Genomes|Genetics）

研究背景：隨著(zhù)工業(yè)化和城市化進(jìn)程的推進(jìn)，多環(huán)芳烴類(lèi)污染物在水體沉積物中頻繁檢出，給水生態(tài)安全和人類(lèi)健康造成極大威脅。本研究通過(guò)結合梯度稀釋培養法、傳統的分離培養技術(shù)以及宏基因組這這下學(xué)分析等多種方法手段，深入解析了黑臭河流沉積物中硫酸鹽呼吸耦合多環(huán)芳烴降解的核心功能微生物組。

測序策略：三代測序（ONT）+Hi-C

研究結論：通過(guò)ONT和高通量染色體構象捕獲 (Hi-C) 技術(shù)得到了S. latifolia SP-C菌株基因組完成圖。本次總共產(chǎn)生8.24 Gb的ONT數據，S. latifolia的測序覆蓋率為198.08X，通過(guò)組裝得到了41.41 Mb的高質(zhì)量基因組，scaffold和contig N50 的大小分別為3.31和1.51Mb。通過(guò)Hi-C輔助組裝技術(shù)進(jìn)一步組裝成12條染色體的基因組，這些染色體包含93.56%的堿基，基因組的17.47%由重復序列組成。此外，預測了13103個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，其中98.72%的基因獲得了功能注釋?zhuān)珺USCO評估完整度為92.07%。在S. latifolia基因組中還鑒定出126個(gè)tRNA、75個(gè)rRNA和36個(gè)其他非編碼RNA，利用OrthoMCL對S. latifolia單拷貝和多拷貝進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現S. latifolia SPC與S.crispa SCP的共同基因多于S. latifolia CCMJ1100，系統發(fā)育顯示，S. latifolia SPC與S.crispa SCP有更緊密的親緣關(guān)系，MCScanX共線(xiàn)性分析證實(shí)了上述結果。

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