1、提取方法

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動(dòng)物組織的話(huà)加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過(guò)1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無(wú)菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無(wú)菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無(wú)菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時(shí)離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時(shí)離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開(kāi)蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類(lèi)植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動(dòng)物組織在裂解時(shí)加入2%的蛋白酶K；宏基因組項目提取在裂解時(shí)加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 使用 Qubit（廠(chǎng)家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

2.2判定標準

濃度≥5ng/ul

總量大于等于8 0 ng

主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上

核酸狀態(tài)正常

3、建庫方法

3.1建庫流程圖

3.2樣本稀釋

1)核對任務(wù)單中項目樣品基本信息，根據信息單一一對應排好樣本

2)根據標準用量，計算“稀釋后濃度(ng/μL)”和“吸取體積(μL)”

3)取已滅菌的國產(chǎn)96孔PCR板，在板子上標注相應的項目編號、板號、日期及稀釋字樣，并開(kāi)始稀釋

4)稀釋后，震蕩輕混（勿劇烈震蕩）并瞬時(shí)離心，對稀釋后的樣品取2 μL做Nanodrop 檢測

5)如果濃度與理論濃度偏差較大先檢查樣品是否用錯，在確認樣品使用無(wú)誤的情況下，濃度高的加水稀釋?zhuān)瑵舛鹊偷募覦NA或者重新稀釋

3.3步驟A

根據任務(wù)單的酶切方案選擇下面所列單酶切或雙酶切方案，取適當起始量樣本，進(jìn)行37℃酶切反應，在水浴鍋中反應時(shí)長(cháng)不超過(guò)15h

3.4步驟B

在上述反應產(chǎn)物中加入試劑，在PCR儀器中進(jìn)行3′端加A處理

3.5步驟C

向上述產(chǎn)物中加入一定體積的連接試劑及index，充分混勻，進(jìn)行Dual-index測序接頭反應

3.6PCR 擴增及電泳檢測

1)加入 PCR 反應所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據 PCR 反應條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴增

3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測

3.7PCR 產(chǎn)物的純化及電泳檢測

1)將全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化

A.將MagicPure Size Selection DNA Beads（全式金）磁珠提前 30min 室溫平衡備用

B.將PCR產(chǎn)物轉入 1.5mL 離心管中，加入（0.8 X）體積已混勻的磁珠，吹吸混勻

C.旋轉混勻儀上，室溫混勻，瞬時(shí)離心，而后置于磁力架上，靜置，移棄上清液

D.離心管置于磁力架上，向離心管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s，移棄上清液

E.重復步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時(shí)離心，用 10μL 槍頭將上清液去除干凈

F.離心管置于磁力架上，打開(kāi)管蓋，室溫干燥至磁珠表面無(wú)光澤，有細微裂紋

G.取下離心管，加入無(wú)菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉入新的 0.2mL PCR 管中

2)對PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測

3.8定量及混樣

1)將PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行Nanodrop 定量

2)根據上機數據量及定量結果，電泳結果，回收膠電泳上樣量，進(jìn)行混樣量計算

3)向1.5ml離心管中按照計算好的混樣量，加入PCR純化產(chǎn)物，并混合均勻

3.9電泳切膠

1)配制2%電泳回收膠

2)使用TAE跑電泳，根據下單規定的切膠范圍進(jìn)行切膠

3)對切膠片段進(jìn)行過(guò)柱純化回收

3.10上機文庫構建PCR擴增

1)在上述膠回收產(chǎn)物中加入 PCR 反應所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據 PCR 反應條件，放入 PCR 儀中進(jìn)行 PCR 擴增及純化

3.11上機文庫準備

將PCR純化產(chǎn)物出庫，進(jìn)行后續文庫質(zhì)檢及上機測序

3.12文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過(guò) Qsep-400進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0進(jìn)行文庫濃度的定量

2)質(zhì)檢標準：濃度≥1ng/ul ，峰圖在要求切膠范圍之內，片段單一無(wú)雜峰

3.13建庫試劑耗材

1)文庫構建試劑：NEB（New England Biolabs）（使用的是單個(gè)散裝試劑，不是成套試劑盒，具體試劑保密）

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標準DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.14建庫設備

4、測序方法

測序設備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit

棉花是重要的經(jīng)濟作物，提供了高質(zhì)量的棉纖維用于工業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)使用。不斷增長(cháng)的工業(yè)需求給棉花增產(chǎn)提出了更高的要求。單鈴重是重要的產(chǎn)量構成因子之一，如何在不降低其他纖維品質(zhì)的前提下提高產(chǎn)量是育種家孜孜以求的目標。通過(guò)MAS輔助育種能夠直接對基因型進(jìn)行選擇?；谶z傳圖譜的QTL定位研究可以定位到相應的功能基因或者與功能基因緊密連鎖的分子標記，因此能極大地促進(jìn)MAS研究。常規的SSR標記很難構建飽和的遺傳圖譜，而利用SNP標記則可以解決這個(gè)問(wèn)題。利用高通量測序技術(shù)能夠對全基因組開(kāi)發(fā)SNP標記，使高密度遺傳圖譜構建成為可能。
本研究利用SLAF-seq技術(shù)對包含196個(gè)子代的陸地棉RIL群體構建高密度遺傳圖譜，并結合多年多點(diǎn)單鈴重的表型數據進(jìn)行QTL定位。同時(shí)針對QTL定位區域進(jìn)行候選基因的挖掘。

材料和方法

本文親本是0-153和sGK9708，0-153纖維品質(zhì)較好，而sGK9708產(chǎn)量潛力高且適應性廣。雙親單鈴重性狀差異極顯著(zhù)。F6:8重組自交系196個(gè)。方法：利用SLAF-seq技術(shù)構建高密度遺傳圖譜并進(jìn)行QTL定位。QTL定位軟件：Windows QTL Cartgrapher 2.5。

結果分析

共獲得443.56M reads共計87.89GB數據。數據Q20為82.24%，GC含量為34.47%。親本共開(kāi)發(fā)SLAF標簽5.3萬(wàn)個(gè)，深度分別為78.66X和102.13X。子代平均開(kāi)發(fā)5萬(wàn)個(gè)SLAF標簽，平均深度為14.5X?；赟LAF標簽共開(kāi)發(fā)出160876個(gè)SNP，其中親本中多態(tài)性有23519個(gè)，多態(tài)率為14.62%。適合棉花作圖的SNP標記（aaxbb型）18318個(gè)，去除低質(zhì)量、低深度和極顯著(zhù)偏分離的標記后后剩余5521個(gè)SNP用于遺傳圖譜構建。構建了棉花A基因組和D基因組連鎖群26個(gè)，共3259.37cM的遺傳圖譜，平均圖距0.78cM。其中A基因組包含標記3550個(gè)，遺傳距離1838.37個(gè)，D基因組包含標記個(gè)1971個(gè)，遺傳距離1971cM。

（1）遺傳圖與棉花物理圖譜共線(xiàn)性分析發(fā)現圖譜覆蓋度良好，絕大多數的SNP與物理圖譜的共線(xiàn)性良好，相對于A(yíng)基因組而言，D基因組的共線(xiàn)性更好。

（2）重組熱點(diǎn)分析發(fā)現26條連鎖群中，21條含有重組熱點(diǎn)區域，A套中9條LG含有重組熱點(diǎn)，D套中12條LG含有重組熱點(diǎn)。所有LG中，13號含有重組熱點(diǎn)最多，有196個(gè)。
結合多年多點(diǎn)的表型數據進(jìn)行QTL定位，共檢測到11個(gè)不同環(huán)境下146個(gè)單鈴重的QTL位點(diǎn)，其中16個(gè)能在至少3個(gè)環(huán)境中重復檢測到。這16個(gè)QTLs中qBW-chr13-7能在7種環(huán)境下檢測到，包含26個(gè)SNP標記，解釋表型變異率在6.13%-14.7%之間。結合參考基因組共鑒定出344個(gè)候選基因，其中340個(gè)基因含有注釋信息，并利用GO，KEGG和KOG數據分別進(jìn)行基因富集分析。為更進(jìn)一步精細定位和MAS育種奠定基礎。

基本測序結果分析：

在自然狀態(tài)下很難保證所有F1群體均是目標親本的子代，所以作者進(jìn)行了親自鑒定的工作，最終剩下157個(gè)正牌的F1子代；
共獲得了139,113,148個(gè)reads，其中Q值大于30以上的高質(zhì)量數據占88.64%，GC含量為37.45%。父母本reads數分別為9,025,115和8,571,660，F1子代平均為773,990。與之對應的高質(zhì)量SLAF-tag數為239,704個(gè)，其中父母本中開(kāi)發(fā)的SLAF-tag數分別為201,805和206,806個(gè)，深度為19.25X和20.70X；子代中平均SLAF-tag為123,038個(gè)，平均深度為3.11X；
聚類(lèi)分析后共獲得多態(tài)性的SLAF-tag132,542個(gè)，其中可成功進(jìn)行二等位編碼的SLAF-tag108,004個(gè)，選擇適合F1群體作圖的多態(tài)性標記后，利用測序深度和完整度過(guò)濾，最終剩余4,508個(gè)多態(tài)性SLAF標記用于遺傳圖譜的構建；

遺傳圖譜構建：

結合506個(gè)SSR標記和4,508個(gè)SLAF標記，進(jìn)行遺傳圖譜的構建，成功構建了珍珠蚌19條連鎖群，共含有標記4,920個(gè)，中性圖總圖距為2,713cM，平均圖距為1.81cM。雄性圖包括3,233個(gè)標記，總圖距2,561cM，雌性圖包含標記3,123個(gè)，總圖距2,810cM；

圖1 珍珠蚌高密度遺傳圖譜

遺傳圖譜比較統計分析：

作者之前利用SSR標記做的遺傳圖譜和利用SLAF-seq構建的遺傳圖譜進(jìn)行了比較。兩張遺傳圖譜均構建了珍珠蚌19條連鎖群，但是標記數，圖距，分辨率均不同。SSR標記包含了506個(gè)標記，總圖距1,922.3cM，平均圖距3,99cM，大的Gap數較多，而基于SLAF-seq的圖譜在以上指標上均顯著(zhù)優(yōu)于SSR標記圖譜。

QTL定位分析：

共定位到了26個(gè)和珍珠品質(zhì)相關(guān)的QTL，分別位于第1,4,8，14，15和17號連鎖群上，PVE范圍為8.45%-22.8%。在1號連鎖群上定位到3個(gè)殼寬QTLs，在第1和第15號連鎖群上分分別定位到1個(gè)控制殼重的QTL。第8號染色體上定位到體重相關(guān)的7個(gè)QTL，另外，作者也定位到了大量其他性狀的QTL。同時(shí)對第17號染色體上的4個(gè)和貝殼珍珠層顏色相關(guān)的QTL進(jìn)行簡(jiǎn)單的統計驗證。

文章亮點(diǎn)總結：

1.材料：珍珠蚌需要生長(cháng)到一定年限才能有珍珠產(chǎn)生，本文材料非常難得，是能獲得較好結果的基礎；2.有SSR遺傳圖譜的構建，并與SLAF標記進(jìn)行了整合，圖譜密度高；
3.利用遺傳圖譜定位到了大量和珍珠質(zhì)量相關(guān)的QTL，相關(guān)標記可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于分子標記輔助育種，具有重要的經(jīng)濟價(jià)值；
4.部分QTL區域的標記進(jìn)行簡(jiǎn)單的統計學(xué)驗證，使QTL定位結果的可靠性增加。
本期文獻解讀就到這里，提前透露下，圖譜君最近正在運作另外一篇水產(chǎn)物種的圖譜構建，QTL并且利用一種高（漲）逼（姿）格（勢）的方法進(jìn)行QTL驗證的文章，敬請期待~~~

參考文獻：
Bai Z Y, Han X K, Liu X J, et al. Construction of a high-density genetic map and QTL mapping for pearl quality-related traits in Hyriopsis cumingii[J]. Scientific Reports, 2016, 6.