1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實(shí)驗平臺空間轉錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細閱讀。

1.2 聲明

我國法定的傳染病分為三大類(lèi)：甲類(lèi)（一類(lèi)）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類(lèi)（二類(lèi)）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲(chóng)、瘧疾。丙類(lèi)（三類(lèi)）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結膜炎、黑熱病、絲蟲(chóng)病、包蟲(chóng)病、還有除了霍亂、細菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國家的相關(guān)規定，為嚴格遵守國家法律法規，本著(zhù)對社會(huì )及相關(guān)操作人員負責的態(tài)度，我司要求客戶(hù)方真實(shí)準確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說(shuō)明。樣品中含有上述感染性病原體時(shí)，客戶(hù)方需要提供符合生物安全等級要求的實(shí)驗室以便開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗，實(shí)驗進(jìn)行時(shí)，客戶(hù)方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗員做好實(shí)驗安全防護?？蛻?hù)方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現樣品含有感染性病原體而客戶(hù)事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現我司將停止進(jìn)行相關(guān)項目，已產(chǎn)生的費用由客戶(hù)方承擔。如因客戶(hù)方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴重后果的，我司將按規定報告國家相關(guān)部門(mén)，并將通過(guò)法律等手段追究相關(guān)責任。

2、項目流程

目前百邁客空間轉錄組測序服務(wù)模式默認為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門(mén)服務(wù)，請與百邁客技術(shù)人員確認實(shí)驗室儀器設備情況。

組織寄送前請至少提前1周進(jìn)行預約，百邁客接收到樣本并確認樣本無(wú)異常后，3-5天內安排RNA質(zhì)檢并反饋質(zhì)檢結果，質(zhì)檢合格后安排切片、組織結構確認與透化。

圖 1 百邁客新鮮冷凍樣本空間轉錄組服務(wù)流程

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x空間轉錄組每塊組織樣本長(cháng)寬不宜超過(guò)6.5*6.5mm，百創(chuàng )S3000空間轉錄組每塊組織樣本長(cháng)寬不宜超過(guò)6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉錄組每塊組織樣本長(cháng)寬不宜超過(guò)11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個(gè)包埋成一個(gè)OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面充分利用捕獲區域。

注1：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)動(dòng)物樣本最好準備至少2個(gè)包埋塊，1份用于RNA質(zhì)檢（切片質(zhì)控標準見(jiàn)第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

注2：在樣本量足夠的情況下，每個(gè)植物樣本最好準備至少3個(gè)包埋塊，因植物組織目的結構較薄，實(shí)驗建議進(jìn)行全流程方案進(jìn)行空間實(shí)驗，即一個(gè)包埋塊在一次切片實(shí)驗中完成結構確認，貼片表達，貼片透化，避免反復切片導致結構損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

3.2 樣本采集與運輸

3.2.1 采集前準備

1. 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預冷；
2. 在醫用托盤(pán)上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無(wú)菌布，將個(gè)體放在無(wú)菌布上進(jìn)行取樣，保持整個(gè)取樣過(guò)程在低溫中進(jìn)行，可以延緩核酸的降解，（動(dòng)物組織建議針對活體或剛死亡個(gè)體進(jìn)行解剖取樣）；
3. 動(dòng)物組織如果取樣后無(wú)法立即進(jìn)行后續包埋實(shí)驗，可以將樣本清理干凈后，暫時(shí)放入組織保護液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時(shí)間最長(cháng)不要超過(guò)5h，以免造成RNA降解，RIN值質(zhì)檢不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進(jìn)行包埋，OCT使用前在冰上預冷30分鐘。

3.2.2 動(dòng)物樣本采集

1. 取下新鮮組織，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類(lèi)型，對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應將周?chē)哪[瘤組織切除干凈）；
2. 迅速用預冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無(wú)菌紗布吸凈表面液體；
3. 如果組織體積較大，需要將組織切成長(cháng)寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng )S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號包埋盒進(jìn)行包埋；取下的組織應立即進(jìn)行后續包埋實(shí)驗。

注：原則上實(shí)驗室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶(hù)網(wǎng)上自行購買(mǎi)，如有需要請聯(lián)系運營(yíng)確認實(shí)驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運送，實(shí)驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3?植物樣本采集

1. 培養基培養樣本：在無(wú)菌超凈臺中取出組織，去除組織表面附著(zhù)的培養基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區域組織置于培養皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區域外的組織結構盡量去除，若組織內部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng )S3000）的小塊；
2. 土壤培養樣本：將組織從培養土中完整取出，去除土壤及雜質(zhì)，用超純水將組織表面土壤及雜質(zhì)徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標區域組織置于培養皿中，利用4℃預冷的鑷子和剪刀將目標區域外的組織結構盡量去除，若組織內部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng )S3000）的小塊；
3. 將目標組織按照不同組織類(lèi)型包埋方法進(jìn)行包埋

注：原則上實(shí)驗室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶(hù)網(wǎng)上自行購買(mǎi)，如有需要請聯(lián)系運營(yíng)確認實(shí)驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無(wú)法分裝運送，實(shí)驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4?動(dòng)物組織速凍包埋

下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶(hù)可根據實(shí)驗條件進(jìn)行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類(lèi)型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護細胞完整性，但操作較復雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進(jìn)行冷凍包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

無(wú)需異戊烷，直接用干冰粒進(jìn)行包埋。

1. 將新鮮組織置于培養皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周?chē)?，盡量使組織表面干燥；
2. 標記包埋盒（樣本名稱(chēng)、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
3. 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
4. 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì )變白，將很難確定組織的方向）；
5. 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì )影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。
6. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法2?異戊烷+液氮包埋法

腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進(jìn)行包埋。

1. 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
2. 將新鮮組織置于培養皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周?chē)?，盡量使組織表面干燥；
3. 標記包埋盒（樣本名稱(chēng)、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標記，一旦冷凍包埋盒將很難標記信息）；
4. 將包埋盒轉移到冰上，在包埋盒中注入預冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
5. 冰上預冷鑷子，將組織放入OCT中，調整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒(méi)有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結構（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會(huì )變白，將很難確定組織的方向）；
6. 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內，直到組織凍結，冷凍時(shí)間可根據組織類(lèi)型和大小而變化（如下圖）；
7. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開(kāi)，目標區域外組織需盡可能全部去除。

2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。

3）冰上預冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無(wú)吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過(guò)程組織上浮在OCT表面，打開(kāi)所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設置成V-AQ，促進(jìn)OCT溶液充分包裹和進(jìn)入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：

4）將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱(chēng)等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預冷的含OCT的包埋盒中 ，加預冷的OCT直至完全包裹組織，并調整組織在OCT中的位置 ，保證目標平面與切面水平一致，如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。

6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會(huì )影響組織的方向，同時(shí)能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結變白（如下圖，右）。

7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法二?：直接冷凍OCT包埋（無(wú)需抽真空）

1. 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
2. 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3. 將包埋盒放置在冰上 ，標記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱(chēng)等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
4. 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
5. 調整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標平面與切面水平一致。如果多個(gè)組織包埋在一起時(shí)一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6. 用異戊烷（足以完全浸沒(méi)組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時(shí)間不宜太久，防止異戊烷凝結 。（若無(wú)異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用鑷子夾住包埋盒置于預冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒(méi)）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
8. 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標記，利用干冰運輸。

方法三?：石蠟包埋

石蠟包埋請使用百邁客專(zhuān)用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類(lèi)型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。

詳細操作步驟請查看試劑盒說(shuō)明書(shū)（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷(xiāo)售）

3.2.6?樣本寄送運輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長(cháng)期保存，或者放置在干冰上進(jìn)行冷凍運輸，寄送到百邁客實(shí)驗室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。

不規范送樣示例：

A.包埋時(shí)組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導致樣本RNA降解，質(zhì)檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導致樣本降解，組織兩側無(wú)OCT支撐，展片時(shí)可能會(huì )破壞樣本結構；

C.組織較小，不滿(mǎn)足做表達最小25%的要求；

D.同一個(gè)包埋塊包埋了多個(gè)樣本，但不在同一個(gè)平面，并且每一個(gè)樣本組織過(guò)小，覆蓋區域有限，可能導致分析有效數據偏低。

3.3?切片質(zhì)控標準

• 組織形態(tài)學(xué)檢測：對動(dòng)物組織切片進(jìn)行H&E染色，對植物組織切片進(jìn)行甲苯胺藍染色，觀(guān)察是否獲取到目標區域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
• RNA完整性檢測：收取10-15張切片，利用Agilent2100對樣本進(jìn)行RNA完整性檢測，要求RNARIN≥6，則認為樣本完整性滿(mǎn)足實(shí)驗要求，可以進(jìn)行后續實(shí)驗。具體切片質(zhì)檢量如下：

1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質(zhì)檢量要求~20張（左圖）；

2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質(zhì)檢量要求~15張（右圖）。

3.4 測序數據量推薦

測序數據量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng )S3000推薦250G/樣；

測序平臺：SURFSeq?5000

研究背景

大白菜是一種重要的結葉蔬菜作物。在抽穗期，葉片內外表現出明顯的形態(tài)分化。然而，這種復雜的葉片形態(tài)分化的遺傳控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期連續的頭葉從內到外的轉錄組譜，通過(guò)在24個(gè)不同的葉片組織中展示了全基因組基因表達的序列-空間剖面，確定了可能在葉片抽穗中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵過(guò)渡頭葉片，為葉狀頭部的形成提供新見(jiàn)解。

材料方法

在溫室盆栽大白菜，使用11周大的植物進(jìn)行取樣。隨機選擇兩個(gè)正常生長(cháng)的大白菜。從外葉到內葉的所有頭葉（葉長(cháng)>2cm）按順序分離收集，而帶有莖尖分生組織(SAM）的幼葉和小內葉（葉長(cháng)<2cm）不分離，按順序收集。從每個(gè)大白菜頭部共得到30片葉子。從內到外，每3片形態(tài)相似、大小相近的葉子為一葉輪，共得到10葉輪葉。

從每輪葉片中選取一片葉子，命名為L(cháng)1-L10，選擇SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9進(jìn)行轉錄組分析。對于RNA-seq，L2被分為兩部分，葉柄(L2R2）和葉片(L2R1），對于L3、L5、L7和L9，則分為五個(gè)區域，包括頂部(R1）、外緣(R2）、葉片的中部區域(R3）、葉柄的頂部(R4）和中部(R5）區域進(jìn)行采樣。對來(lái)自?xún)蓚€(gè)生物學(xué)重復（兩個(gè)葉頭）共計48個(gè)樣品用Illumina平臺進(jìn)行轉錄組測序。

圖1. 跨越11個(gè)葉子層的葉子的代表性圖片

研究結果

1、轉錄組測序

對48個(gè)樣本進(jìn)行轉錄組測序，共產(chǎn)生7.43×108高質(zhì)量cleanreads，皮爾遜相關(guān)系數為0.92-0.99，所有生物學(xué)重復都高度相關(guān)。將cleanread與大白菜參考基因組進(jìn)行比對，計算基因表達量TPM值，共鑒定出27,876個(gè)基因。其中，75.08%的基因在所有樣品中都有表達。

主成分分析(PCA）顯示沿主成分(PC）1和2有明顯的分離。PC1根據與SAM的距離將葉片樣本分開(kāi)，而PC2將葉片和葉柄組織分開(kāi)。層次聚類(lèi)分析將樣本分為五類(lèi)，與葉子形態(tài)分化一致。SAM和L1的樣本形成內葉1(IL1）最接近莖尖的組織。內葉2的葉片（IL2B）和內葉2的葉柄（IL2P）代表L2-L5的葉片和葉柄組織，而外葉（OLB）和外葉柄（OLP）代表L2-L5的葉片和葉柄組織外葉（L7和L9），與葉子形態(tài)分化一致。

圖2. 抽穗期不同葉層大白菜葉片的轉錄組分析

2、差異表達基因分析

作者在全基因組水平上鑒定了不同葉片中的差異表達基因（DEG），以探索葉片之間的多樣性和潛在功能。通過(guò)分析，共發(fā)現9,133DEG，k-means聚類(lèi)將差異基因分為14個(gè)共表達簇(CEC1-CEC14），這些CEC與圖1中的5個(gè)聚類(lèi)簇緊密相關(guān)。IL1中DEGs的高表達水平以CEC1和2為代表。CEC1在SAM中高度表達，并以與分生組織發(fā)育、組織發(fā)育和近軸/遠軸極性相關(guān)的基因為代表。CEC2在SAM和L1高表達，包含與細胞分裂、細胞增殖、細胞生長(cháng)和生長(cháng)素生物合成過(guò)程相關(guān)的基因。IL2B中DEG的高表達水平以CEC4-6為代表。CEC4、5和6均富集于有機酸代謝過(guò)程、淀粉代謝過(guò)程、質(zhì)體組織和硫苷代謝、光合光反應等過(guò)程。IL2P中DEGs的高表達以CEC9為代表。CEC9富含植物細胞壁相關(guān)過(guò)程，包括壁組織或生物發(fā)生，以及果膠代謝過(guò)程。OLB中DEGs以CEC7和8為代表。CEC7在L7葉片中高表達，并以與蛋白質(zhì)修飾過(guò)程、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性相關(guān)的基因為代表。這些結果反映L7具有明顯的信號轉導和基因調控特征。CEC8在L9葉片中高表達，含有一組與葉綠素分解代謝過(guò)程、細胞分解代謝過(guò)程、防御反應調節、果糖反應和脫落酸激活信號通路相關(guān)的基因。OLP中DEG的高表達水平以CEC11和12為代表。CEC11中的基因在L7-L9的葉柄中高度表達，在任何基因本體(GO）術(shù)語(yǔ)中均未富集。CEC12中的基因在L9的葉柄中高度表達。這些基因可能主要參與脫落酸激活的信號通路、茉莉酸（JA）代謝過(guò)程、JA反應、防御反應、生物刺激反應、水楊酸反應和外部刺激反應。這些結果表明，L9可能在保護多葉頭部免受外部損害方面發(fā)揮作用。

圖3.差異基因在不同葉子中的表達譜

3、葉片發(fā)育相關(guān)基因的表達揭示葉球形成中的關(guān)鍵過(guò)渡葉

作者鑒定了細胞增殖相關(guān)基因和細胞擴張相關(guān)基因。結果表明，大多數細胞增殖基因在IL1HLs中達到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下調(圖3A），表明細胞增殖基因在不斷生長(cháng)的內葉的起始過(guò)程中發(fā)揮重要作用。與細胞增殖基因不同，大部分細胞擴張基因在IL2HLs和外HLs的葉片區域高表達，且表達模式更為多樣，分為4個(gè)簇(圖3A）。此外，大部分細胞擴張基因在IL2HLs和外層HLs之間表現出不同的表達模式，導致L7細胞分裂和細胞擴張調控的變化明顯高于IL2HLs和外層葉(圖3B）。

圖4. 細胞增殖和細胞擴增基因的表達模式

大白菜HLs的彎曲通常被認為是由葉片正軸和背軸之間的不對稱(chēng)細胞生長(cháng)引起的。通過(guò)分析ad-ab極性基因的表達模式，以探究ad-ab極性基因在頭葉曲率中的作用。結果表明，與內部HL相比，大多數ad-ab極性基因在外部HL中顯示出顯著(zhù)不同的表達模式。

圖5.?ad-ab極性基因的表達譜。

通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、PCA和聚類(lèi)分析，以及與細胞分裂/擴張和ad-ab極性相關(guān)的基因表達，L7位于內葉和外葉之間的邊界。作者通過(guò)主成分分析和聚類(lèi)將L7分類(lèi)為外葉組，最終確定L7是顯示三種模式的過(guò)渡狀態(tài)。此外，作者進(jìn)一步分析了HLs中可溶性糖的積累和相關(guān)基因的表達特征，進(jìn)一步證實(shí)L7是葉狀頭部發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)渡葉。

4、加權基因共表達網(wǎng)絡(luò )分析

為確定導致過(guò)渡葉特殊狀態(tài)的形成過(guò)程，作者進(jìn)行加權基因共表達網(wǎng)絡(luò )分析（WGCNA）。WGCNA共確定了17個(gè)模塊。其中，五個(gè)模塊（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）與過(guò)渡葉密切關(guān)聯(lián)。兩個(gè)模塊，greenyellow和magenta，與過(guò)渡葉特別相關(guān)，并包含許多編碼蛋白激酶的基因，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK）、鈣依賴(lài)性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受體樣激酶。關(guān)鍵過(guò)渡葉片L7可能受到復雜信號相互作用的調節，不僅是光和其他外部刺激，也有內部激素。

文章亮點(diǎn)

作者報道了大白菜抽穗期的轉錄組圖譜，利用24個(gè)空間解剖組織，分別代表大白菜內外葉的不同區域。全基因組轉錄組分析清楚地將內葉組織與外葉組織分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)對葉片發(fā)育和糖代謝關(guān)鍵基因的空間表達分析，確定了關(guān)鍵過(guò)渡葉，關(guān)鍵過(guò)渡葉是第一批內彎的葉片。關(guān)鍵過(guò)渡葉的形成由一個(gè)復雜的信號網(wǎng)絡(luò )控制，不僅包括內部激素和蛋白激酶，還包括外部光和其他刺激。這個(gè)發(fā)現為揭示抽穗性狀的遺傳控制提供了新的見(jiàn)解和豐富的資源。研究過(guò)程中作者利用生活中常見(jiàn)材料，結合轉錄組進(jìn)行分析，思路簡(jiǎn)單，設計巧妙，值得借鑒學(xué)習。

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2022年值得關(guān)注的7大技術(shù)榜單

2021年利用空間轉錄組測序技術(shù)發(fā)文章呈現井噴式增長(cháng)，其中已正式發(fā)表文章有40余篇，而空間轉錄組學(xué)為特色的預印本bioRxiv搜索“空間轉錄組學(xué)（spatial transcriptomics）”一詞，獲得了500余條結果，其中80余條是在2021年提交的，可以說(shuō)2021年是空間轉錄組測序技術(shù)應用好文發(fā)表突飛猛進(jìn)的一年。

2016年-2021年空間轉錄組文章發(fā)表趨勢和影響因子分布

通過(guò)檢索空間轉錄組發(fā)表文章的數據分析來(lái)看，該技術(shù)在2021年中得到廣泛應用，并且文章影響因子主要集中在10~20分區間，其占比高達39%，其次在30分以上占比達到30%，由此可見(jiàn)空間轉錄組測序技術(shù)的應用極大提升了文章的質(zhì)量和檔次。

不僅如此，2021年空間轉錄組測序技術(shù)還在物種上有了新的突破，不再局限于人和鼠常見(jiàn)的模式物種，已經(jīng)開(kāi)始邁入哺乳動(dòng)物（豬）、家禽類(lèi)（雞）、植物類(lèi)（擬南芥、云杉、楊樹(shù)）等新的物種領(lǐng)域，極大拓展其應用范圍。

物種空間轉錄組文獻發(fā)表統計

2021年空間轉錄組在不同組織部位上應用也取得一些新進(jìn)展：比如骨組織一類(lèi)就有不少文章發(fā)表，有頭蓋骨[PNAS，IF=11.2]、腰骨骼肌[NatureCommunications，IF=14.9]、肩部肌腱[AnnRheum Dis，IF=19.1 ]；生殖器官有子宮內膜[Nat Genet，IF=27.6]、卵巢[NatureBiotechnology，IF=54.9]；泌尿系統：前列腺[Nature Communications，IF=14.9]、膀胱[NatureCommunications，IF=14.9]；腸道組織：胎兒腸道[Cell，IF=41.6]；脂肪組織：皮下腹部[CellMetabolism，IF=27.3]；腦組織：腦內炎癥[[Ann Rheum Dis，IF=19.1 ]，IF=24.9]、等皮質(zhì)和海馬[Cell，IF=41.6]、腦神經(jīng)系統[AnnuRev Neurosci，IF=12.4]、前額葉皮層[Nat Neurosci，IF=24.9]、海馬和前額葉皮質(zhì)[NatureCommunications，IF=14.9]等都組織區域都有不錯的研究報道，甚至連取材最困難的皮膚樣本都發(fā)表重要研究成果：皮膚肉芽腫[Nature Immunology ，IF=25.6]，空間轉錄組逐漸在更多的組織類(lèi)型上得到廣泛的應用，揭示更深層次空間維度生物學(xué)表型。

空間轉錄組不同組織應用發(fā)表文獻統計

基于上面數據我們不難看出來(lái)前期研究，腦組織空間基因表達探索最為廣泛，當然還有心臟組織、肝組織前列腺組織；植物主要集中在花序器官的研究，隨著(zhù)各種組織探索和嘗試，基本上空間轉錄組已經(jīng)在各種組織中全面開(kāi)火，不管從技術(shù)的前瞻性也好，還是從空間這個(gè)維度深度闡釋一些生物學(xué)現象，彌補了細胞空間位置信息的趨勢，空間多組學(xué)技術(shù)毫無(wú)疑問(wèn)成為引領(lǐng)科學(xué)研究的風(fēng)向標。

后續文章，敬請關(guān)注：

2021年度空間轉錄組動(dòng)植物四大應用方向：時(shí)空圖譜篇（發(fā)育）、腫瘤篇、疾病機制篇、生物進(jìn)化篇

關(guān)注我們

大腦是一個(gè)具有精密組織結構的重要器官。對于大腦結構-功能的關(guān)系、發(fā)育過(guò)程中大腦皮層以及退行性神經(jīng)疾病領(lǐng)域的研究，空間轉錄組可以揭示更多的信息。單細胞和空間轉錄組結合可以將關(guān)注的細胞類(lèi)型及亞型√確的錨定到空間位置上，解析不同功能區域與細胞類(lèi)型及亞型的關(guān)聯(lián)性。

文獻一

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實(shí)驗材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進(jìn)行scRNA-seq，共捕獲79944個(gè)星形膠質(zhì)細胞。3個(gè)LPS和saline小鼠大腦組織切片進(jìn)行空間轉錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉變。這種轉變是如何受到時(shí)間和性別的影響，它在單細胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結論：在本研究中作者使用細菌細胞壁內毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞在急性炎癥刺激后的轉錄組變化。發(fā)現星形膠質(zhì)細胞的轉錄組變化發(fā)生在數小時(shí)內，隨著(zhù)時(shí)間的推移急劇變化。通過(guò)對約80000個(gè)星形膠質(zhì)細胞進(jìn)行單細胞測序，發(fā)現炎癥引起廣譜的反應，亞型星形膠質(zhì)細胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉變，并具有明確的轉錄組特征。利用空間轉錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導的反應性星形膠質(zhì)細胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區域?？傊?，數據集為分析星形膠質(zhì)細胞異質(zhì)性提供了強大的資源，并將有助于理解局部受限反應性星形膠質(zhì)細胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖1 DLPFC組織空間轉錄組學(xué)

文獻二

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實(shí)驗材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進(jìn)行scRNA-seq，共捕獲79944個(gè)星形膠質(zhì)細胞。3個(gè)LPS和saline小鼠大腦組織切片進(jìn)行空間轉錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉變。這種轉變是如何受到時(shí)間和性別的影響，它在單細胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結論：在本研究中作者使用細菌細胞壁內毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞在急性炎癥刺激后的轉錄組變化。發(fā)現星形膠質(zhì)細胞的轉錄組變化發(fā)生在數小時(shí)內，隨著(zhù)時(shí)間的推移急劇變化。通過(guò)對約80000個(gè)星形膠質(zhì)細胞進(jìn)行單細胞測序，發(fā)現炎癥引起廣譜的反應，亞型星形膠質(zhì)細胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉變，并具有明確的轉錄組特征。利用轉空間錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導的反應性星形膠質(zhì)細胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區域?？傊?，數據集為分析星形膠質(zhì)細胞異質(zhì)性提供了強大的資源，并將有助于理解局部受限反應性星形膠質(zhì)細胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖2 單細胞轉錄組鑒定星形細胞亞群及空間轉錄組細胞定位

文獻三

英文題目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文題目：成年小鼠腦分子圖片

期刊：Science advances

IF：13.116

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32637622

實(shí)驗材料：三只雄性小鼠（9周齡）的大腦

研究背景：在建立子區域及其邊界的參考圖以及確定神經(jīng)元類(lèi)型及其連接性的多樣性方面，對成年大腦進(jìn)行映射是探索定義動(dòng)物行為多樣性的腦回路的結構與功能關(guān)系的核心。實(shí)驗神經(jīng)科學(xué)依賴(lài)于重復準確地記錄和操縱特定大腦區域中神經(jīng)元亞型活動(dòng)的能力，因此，基因靶向方法已被證明在針對細胞類(lèi)型的靶向中極為有價(jià)值。

研究結論：作者基于全腦范圍內ST模式的無(wú)監督分類(lèi)建立了成年小鼠大腦的分子圖譜。這種方法是一個(gè)在全腦范圍內映射離散空間域的無(wú)偏方法，并且還利用空間信息開(kāi)發(fā)分子方法以研究神經(jīng)系統組織，引入了分子和空間代碼進(jìn)化保守性的能力，以及它們與生理學(xué)和病理學(xué)的關(guān)系。另外作者簡(jiǎn)化了大腦基因索引測試區域分類(lèi)的能力，這些基因也足以將整個(gè)成年大腦映射到相關(guān)的子區域。這種方法從分子視角對全腦進(jìn)行分類(lèi)繪制圖譜，并比較物種間腦區域分布的保守分子標記，可作為關(guān)鍵點(diǎn)為治療腦部疾病提供新策略。

圖3 空間轉錄組繪制全腦分子圖譜

空間轉錄組在神經(jīng)學(xué)方向研究思路

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