研究背景

水稻是最重要的糧食作物之一，在過(guò)去的50年里，通過(guò)雜交育種已經(jīng)大幅度提高了水稻的產(chǎn)量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸，多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優(yōu)勢基因發(fā)生重組和相互作用的可能性，提高水稻對環(huán)境的適應能力。

同源四倍體水稻（autotetraploid rice）是二倍體水稻經(jīng)過(guò)染色體加倍形成的新種質(zhì)。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強大的生物學(xué)優(yōu)勢，蘊含著(zhù)巨大的增產(chǎn)潛力，可望成為未來(lái)水稻育種的新途徑。然而，其雜種F1普遍存在育性偏低，產(chǎn)量?jì)?yōu)勢難以發(fā)揮，在農業(yè)生產(chǎn)上難以直接應用的問(wèn)題。所以，如何創(chuàng )制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體（neo-tetraploid）是利用其優(yōu)勢的關(guān)鍵。

為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問(wèn)題，華南農大某研究組經(jīng)過(guò)20年的努力，培育出2個(gè)新型四倍體水稻，其結實(shí)率可達80%以上，于2016年獲得國家植物新品種權。本研究旨在通過(guò)轉錄組測序，研究新型四倍體（Huaduo 3）與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達情況，為解析新型四倍體育性和雜種優(yōu)勢的分子機制打下基礎。

材料方法

新型四倍體水稻Huaduo 3（H3），40種不同的同源四倍體水稻，以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x（T452）與H3的雜交F1代用于測序分析。
轉錄組測序：取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進(jìn)行轉錄組測序，包括減數分裂階段的花藥、減數分裂階段的子房、開(kāi)花階段的旗葉。每個(gè)組織每種品系有3個(gè)生物學(xué)重復，共27個(gè)樣品。測序平臺為Illumina HiSeq 2500，平均每個(gè)樣品測約5G。
小RNA測序：取T452，H3及雜交F1代的減數分裂階段的花藥進(jìn)行小RNA測序，無(wú)生物學(xué)重復。
全基因組重測序：兩個(gè)親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測序。
嗯，測序手段還是挺多滴！

技術(shù)路線(xiàn)

研究結果

1.新型四倍體水稻Huaduo 3（H3）的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過(guò)程
將兩種同源四倍體水稻（Jackson-4x和96025）進(jìn)行雜交，獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進(jìn)行連續自交，到F5代時(shí)發(fā)現一株水稻有80%的結實(shí)率，這株水稻經(jīng)過(guò)多代連續自交，到F10-F13代時(shí)出現可以穩定遺傳的高結實(shí)率性狀，這個(gè)品系被命名為Huaduo 3（H3）。H3不僅結實(shí)率高，還有其它高產(chǎn)性狀（表1），其花粉母細胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻（26個(gè)印度種和14個(gè)日本種）進(jìn)行雜交，獲得的40種F1代表現出了很多大大優(yōu)于親本的性狀，尤其是單株谷粒數、結實(shí)率、單株產(chǎn)量等性狀。為了進(jìn)一步研究雜交F1代的雜種優(yōu)勢，我們挑選了T452和H3的雜交F1代進(jìn)行轉錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體，雜交F1代的高親優(yōu)勢幾乎都是正的，除了谷粒長(cháng)度和10谷粒寬度兩個(gè)指標。雜交F1代的中親優(yōu)勢除了10谷粒寬度這一個(gè)指標以外都是正的，說(shuō)明雜交F1代表現出了明顯的雜種優(yōu)勢。
高親優(yōu)勢（High-parent heterosis，HPH）是指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數量性狀的數值與高值親本（HP）同一性狀數值差值的比率。高親優(yōu)勢（%）=(F1-HP)/HP*100%。
中親優(yōu)勢（Mid-parent heterosis，MPH）指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數量性狀的數值與雙親（P1和P2）同一性狀的平均值差值的比率。中親優(yōu)勢（%）=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。

表一：T452與H3雜交F1代的雜種優(yōu)勢。HPH：高親優(yōu)勢；MPH中親優(yōu)勢；PH：植株高度；EP：?jiǎn)沃旯攘?；FG：?jiǎn)位ü攘?；SS：結實(shí)率；GYP：?jiǎn)沃戤a(chǎn)量；GL：10谷粒長(cháng)度；GW：10谷粒寬度。

圖1：親本和雜交F1代的表型。（A）Jackson-4x（T45），Huaduo 3（H3）與96025（T44）的谷粒大小，H3是來(lái)自T45和T44的雜交；（B）H3在大田中的長(cháng)勢；（C）T45，H3，T44的植物表型；（D）Shennong15-4x（T424），H3，以及兩者雜交F1代的表型。

2.轉錄組測序
因為T(mén)452和H3的雜交F1代表現出了優(yōu)良性狀，因此可以通過(guò)轉錄組測序研究性狀差異的原因。取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進(jìn)行轉錄組測序，包括減數分裂階段的花藥、減數分裂階段的子房、開(kāi)花階段的旗葉?？偣矞y了548M clean reads，平均有89.06%的reads可以比對到參考基因組上，其中93.45%都是比對到唯一位置上。三個(gè)生物學(xué)重復之間的相關(guān)性都達到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對12個(gè)差異表達基因（DEG）的表達量進(jìn)行了驗證，結果與轉錄組測序的結果一致。對不同樣品進(jìn)行層次聚類(lèi)分析表明，相同組織的樣品總能聚到一塊（圖2）。

圖2：所有基因的層次聚類(lèi)分析。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

3.差異表達基因（DEG）分析及注釋
在三個(gè)不同株系中共發(fā)現17877個(gè)DEG，兩兩比較的DEG數目在1521到2498之間（表2）。F1和親本之間的DEG稱(chēng)為DEGF，親本之間的DEG稱(chēng)為DEGP。DEGF的基因能分為兩個(gè)不同的組，其中一個(gè)組在DEGP里面也有，另一個(gè)組只屬于DEGF，后者被稱(chēng)為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異，因此接下來(lái)的研究種重點(diǎn)關(guān)注DEGFu基因。在這17877個(gè)DEG里面，有1150，1014，1122個(gè)DEGFu與花藥、子房、葉片有關(guān)，其中分別有807，663，866個(gè)基因與花藥、子房、葉片特異相關(guān)，這些基因被稱(chēng)為DEGFu-sp。

表2：三個(gè)不同組織中的差異表達基因統計。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

為了研究DEGFu-sp基因的功能，我們首先研究了其中的轉錄因子，共發(fā)現了44個(gè)轉錄因子，花藥里面16個(gè)，子房里面10個(gè)，葉片里面18個(gè)。對DEGFu-sp基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò )分析表明這些基因相互之間有顯著(zhù)的聯(lián)系，多個(gè)代謝通路富集程度較高。

GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個(gè)生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別顯著(zhù)富集，包括光合作用、代謝途徑、合成調控和轉錄調控。6個(gè)通路類(lèi)別顯著(zhù)富集，包括光合作用和代謝通路。13個(gè)基因在F1中的表達量顯著(zhù)高于T452。在807個(gè)花藥特異的DEGFu-sp中，15個(gè)基因與46個(gè)其它重要基因共表達。

接下來(lái)用同樣的方法對子房和葉片中的DEGFu-sp基因進(jìn)行了GO富集分析。在葉片當中有5個(gè)基因在F1中表達量顯著(zhù)高于T452。H3水稻葉片在開(kāi)花過(guò)程中顏色逐漸變化，而T452葉片在開(kāi)花過(guò)程中顏色保持不變。因此，我們比較了葉片中F1比T452上調的基因，以及H3比T452上調的基因，兩者有74.01%的重合。有趣的是，在葉片中發(fā)現了兩個(gè)主要的功能基因類(lèi)別，分別是程序性細胞死亡和防御反應。

4. 花藥特異性差異表達基因與減數分裂有關(guān)

因為T(mén)452育性較低，而F1代育性較高，為了研究育性的差異，我們重點(diǎn)研究了F1花藥中與T452相比上調的基因。首先，有643個(gè)基因在F1花藥中與T452相比特異上調，這其中排除了H3與T452相比上調的基因。對這643個(gè)基因進(jìn)行GO分析表明，有6個(gè)功能基因類(lèi)別富集，這些基因與防御反應、光合作用、細胞凋亡和程序性細胞死亡有關(guān)。這其中有41個(gè)基因在育性較低的同源四倍體中表達量低于二倍體。在這41個(gè)基因中，4個(gè)基因，LOC_Os04g33830，LOC_Os12g08770，LOC_Os06g21590，LOC_Os07g25430，與光合作用有關(guān)。

接下來(lái)，將這643個(gè)特異上調的基因與野生型水稻花藥減數分裂相關(guān)基因的表達量相互比較，發(fā)現有9個(gè)基因都在減數分裂前期到四分體期表達。

隨后，我們比較了花藥特異性差異表達基因DEGFu-sp和野生型水稻減數分裂相關(guān)基因表達數據，共發(fā)現有42個(gè)減數分裂特異性基因和8個(gè)減數分裂相關(guān)基因（圖3）。在8個(gè)減數分裂相關(guān)的基因中，有兩個(gè)基因和DNA修復和染色體結構有關(guān)。

因為轉錄組也會(huì )被表觀(guān)遺傳調控，我們也進(jìn)了小RNA測序。在花藥中發(fā)現了288個(gè)差異表達的miRNA（DER），其中有13個(gè)為新發(fā)現的。在這288個(gè)DER中，有38個(gè)只在F1與親本相比中特有，這38個(gè)基因被稱(chēng)為DERFu。這38個(gè)DERFu有397個(gè)靶標基因。GO分析表明這397個(gè)靶標基因有7個(gè)功能基因類(lèi)別富集，這些基因與細胞凋亡、防御反應、程序性細胞死亡、細胞自噬、DNA完整性和脅迫反應有關(guān)。而且，大部分靶標基因同于F1或者H3中上調的基因。然后我們比較了這38個(gè)DERFu與之前發(fā)現的差異表達miRNA數據，發(fā)現其中一個(gè)miRNA，osa-miR5072_L-2_1ss3AG，在

Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調。這個(gè)miRNA靶標基因為 LOC_Os02g24960，是一個(gè)逆轉錄轉座子基因。

圖3：與育性和雜種優(yōu)勢相關(guān)的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因，藍色為花藥中的基因，黑色為子房中的基因。

表3：花藥中的差異表達miRNA（DER）列表

5.雜交F1代非累加基因表達
F1代表達的基因可以分成兩個(gè)類(lèi)別，一類(lèi)是累加基因，一類(lèi)是非累加基因。累加基因的表達量來(lái)自?xún)蓚€(gè)親本的等位基因之和，非累加基因的表達量由兩個(gè)親本等位基因的平均值決定。在三個(gè)組織中共發(fā)現了1224個(gè)非累加基因（NDEG），在花藥、子房和葉片中分別為314個(gè)，578個(gè)，332個(gè)。其中895個(gè)上調，329個(gè)下調。通過(guò)對花藥NDEG和水稻花藥減數分裂特異性基因表達數據的比較，發(fā)現了53個(gè)共有的基因。其中有7個(gè)基因在四倍體中表達量低于二倍體水稻。

表4：非累加表達基因（NDEG）和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數量統計。星號表示NDEG在F1表達的總基因中的比例。

6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達基因之間的關(guān)系
DNA重測序表明T452和H3有很多序列差異，兩者共有2351039個(gè)SNP，其中1192412個(gè)SNP在T452中特異存在，374460個(gè)SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個(gè)Indel，其中248194個(gè)Indel在T452中特異存在，84196個(gè)Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比，SNP和Indel多態(tài)性分別為66.77%和69.97%。在這些多態(tài)性位點(diǎn)中，約65%的SNP和72%的Indel在基因區。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達基因的調控區域。另外，有58908個(gè)SNP和5561個(gè)Indel位于基因編碼區。
因為T(mén)452和H3存在大量的DNA序列差異，我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異，結果表明花藥、子房和葉片中分別有330個(gè)、291個(gè)、459個(gè)基因存在DNA序列差異（SNP或Indel）?；ㄋ幭嚓P(guān)的330個(gè)基因可以分為15個(gè)不同的生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別，主要和光合作用、細胞代謝、轉錄和生物合成有關(guān)。子房相關(guān)的基因有1個(gè)生物學(xué)過(guò)程富集，即代謝通路。同樣的，葉片相關(guān)的基因有8個(gè)生物學(xué)過(guò)程富集，包括氮代謝、細胞運輸等。這些富集的生物學(xué)過(guò)程基本上與DEGFu-sp富集的生物學(xué)過(guò)程一致。
另外，非累加差異表達基因中也有SNP和Indel，花藥、子房和葉片中分別有67個(gè)、133個(gè)、87個(gè)基因存在DNA序列差異，并對這些基因進(jìn)行了富集分析。其中25個(gè)基因為轉錄因子。

結論

本研究培育了一個(gè)新型四倍體水稻H3，H3與同源四倍體T452雜交產(chǎn)生的F1代具有育性高、產(chǎn)量高等優(yōu)良的雜種優(yōu)勢性狀。通過(guò)比較H3，T452，以及雜交F1代的三個(gè)不同組織（花藥、子房、葉片）的轉錄組差異，尤其是重點(diǎn)分析了花藥的轉錄組差異，找到了多個(gè)與減數分裂有關(guān)的差異表達基因，這些基因可能與雜種優(yōu)勢有關(guān)。對花藥的小RNA測序也找到了一些F1中差異表達的miRNA，這些miRNA的靶基因也與轉錄組測序中上調的基因有大部分重合，說(shuō)明miRNA可能參與調控了雜交F1代的性狀差異。對兩個(gè)親本DNA序列的差異進(jìn)行全基因組重測序分析，并與轉錄組數據進(jìn)行聯(lián)合分析，找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。

創(chuàng )新點(diǎn)

培育出高結實(shí)率的新型四倍體水稻，可以用于四倍體水稻育種；
轉錄組測序比較了新型四倍體水稻，同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉錄組差異，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因；
小RNA測序和全基因組重測序結果與轉錄組數據相結合，深入解析性狀差異原因。

點(diǎn)評

這篇文章選取的實(shí)驗材料很好，性狀優(yōu)良，而且研究得很深入，比較了三種水稻三個(gè)不同組織的轉錄組，還進(jìn)行了小RNA測序和全基因組重測序。通過(guò)深入分析，找到了一些影響水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因，為后續的育種工作打下了基礎。
對多種測序手段結合分析感興趣的小伙伴快來(lái)試試吧！

參考文獻

Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.