誠然，小編的上一篇(如何讓你的圖變得高大上之ComplexHeatmap())結局得太匆匆，因此，本篇奉上作圖代碼實(shí)例。
本次，我們將展示一個(gè)甲基化與表達譜聯(lián)合分析的熱圖。本著(zhù)先學(xué)習再創(chuàng )造的態(tài)度，小編做了一下知識的搬運工，本篇所有代碼均引用自：Zuguang Gu, Roland Eils and Matthias Schlesner,?Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data,?Bioinformatics, 2016。
我們先上效果圖：
其實(shí)代碼并不長(cháng)，關(guān)鍵在于如何準備作圖所用數據以及對代碼的理解上，所以下面將著(zhù)重對這兩點(diǎn)進(jìn)行解釋說(shuō)明。
>library(ComplexHeatmap)
>library(circlize)
#為了測試方便，用setwd設置工作路徑
setwd(“/media/bmk/***/Meth_Exp”)
#rds格式是一種保存了數據的數據類(lèi)型和結構的格式，可以用函數saveRDS()來(lái)生成這種格式的文件。meth.rds文件來(lái)自R包示例文件，如需查看這個(gè)文件中都是什么，請參考(看不清熱圖的聚類(lèi)結果怎么辦)的方法。另外，文件中只包含了DMR關(guān)聯(lián)基因的甲基化和表達量呈現負相關(guān)的DMR
>res_list?=?readRDS(“data/meth.rds”)
#顯示樣本是腫瘤樣本還是正常樣本的標簽
>type?=?res_list$type
(20個(gè)正常樣本和20個(gè)腫瘤樣本)
#矩陣，其中行對應差異甲基化區域(DMR),矩陣中的值是每個(gè)樣品中DMR中的平均甲基化水平。
>mat_meth?=?res_list$mat_meth
#矩陣，其中行對應于與DMR相關(guān)的基因（即與DMR最近的基因，也可以叫做DMR關(guān)聯(lián)基因），矩陣中的值是每個(gè)樣品中每個(gè)基因的表達水平（對樣品中的每個(gè)基因的表達進(jìn)行了標準化）。
>mat_expr?=?res_list$mat_expr
#甲基化變化的方向(hyper表示腫瘤樣本中高甲基化，hypo表示腫瘤樣本中低甲基化)
>direction?=?res_list$direction
#甲基化與甲基化關(guān)聯(lián)基因相關(guān)性p值
>cor_pvalue?=?res_list$cor_pvalue
#基因類(lèi)型(如蛋白編碼基因或lincRNA等)
>gene_type?=?res_list$gene_type
#DMR注釋到基因的功能區間(如intergenic/intragenic或者TSS
>anno_gene?=?res_list$anno_gene
#DMR到關(guān)聯(lián)基因TSS的距離
>dist?=?res_list$dist
#與增強子重疊的DMR的部分
>anno_enhancer?=?res_list$anno_enhancer
#顏色定義參見(jiàn)上一篇(如何讓你的圖變得高大上之ComplexHeatmap()) ##我們首先定義兩個(gè)列注釋?zhuān)缓笾谱鲝碗s的熱圖。 >ht_global_opt( #Heatmap()實(shí)際上是單一熱圖的類(lèi)構造函數。如果需要組合超過(guò)一個(gè)熱圖，用戶(hù)可以通過(guò)+操作符添加熱圖。默認情況下，將兩個(gè)熱圖通過(guò)+連接后，第二個(gè)熱圖的行聚類(lèi)樹(shù)會(huì )去掉，行的順序會(huì )與是第一個(gè)熱圖的順序保持一致。
##首先計算甲基化矩陣的列聚類(lèi)，以便可以將表達矩陣中的列調整為具有與甲基化矩陣中相同的列順序。
>column_tree?=?hclust(dist(t(mat_meth)))
>column_order?=?column_tree$order
>library(RColorBrewer)
#定義甲基化表達水平顏色，從0/blue-0.5/white-1/red漸變
>meth_col_fun?=?colorRamp2(c(0,?0.5,?1),?c(“blue”,?“white”,?“red”))
#定義甲基化變化方向對應顏色
>direction_col?=?c(“hyper”?=?“red”,?“hypo”?=?“blue”)
#定義表達水平顏色
>expr_col_fun?=?colorRamp2(c(-2,?0,?2),?c(“green”,?“white”,?“red”))
#定義相關(guān)性p值顏色
>pvalue_col_fun?=?colorRamp2(c(0,?2,?4),?c(“white”,?“white”,?“red”))
#定義基因類(lèi)型顏色
>gene_type_col?=?structure(brewer.pal(length(unique(gene_type)),?“Set3”),
names?=?unique(gene_type))
#定義注釋model顏色
>anno_gene_col?=?structure(brewer.pal(length(unique(anno_gene)),?“Set1”),
names?=?unique(anno_gene))
#定義距離顏色
>dist_col_fun?=?colorRamp2(c(0,?10000),?c(“black”,?“white”))
#定義增強子相關(guān)顏色
>enhancer_col_fun?=?colorRamp2(c(0,?1),?c(“white”,?“orange”))
#ht_global_opt()是一個(gè)可選函數，它會(huì )全局控制一些參數。我們可以通過(guò)此全局函數同時(shí)為所有熱圖/注釋設置一些參數。需要注意的是，一定將它放在熱圖代碼(也就是Heatmap())之前，并在繪制熱圖后重置所有選項值以消除對下一個(gè)熱圖的影響。
#可以通過(guò)?ComplexHeatmap::ht_global_opt查看此函數的幫助
>?names(ht_global_opt())????????#可查看該函數可定義的參數
[1]?“heatmap_row_names_gp”
[2]?“heatmap_column_names_gp”
[3]?“heatmap_row_title_gp”
[4]?“heatmap_column_title_gp”
[5]?“heatmap_legend_title_gp”
[6]?“heatmap_legend_title_position”
[7]?“heatmap_legend_labels_gp”
[8]?“heatmap_legend_grid_height”
[9]?“heatmap_legend_grid_width”
[10]?“heatmap_legend_grid_border”
[11]?“annotation_legend_title_gp”
[12]?“annotation_legend_title_position”
[13]?“annotation_legend_labels_gp”
[14]?“annotation_legend_grid_height”
[15]?“annotation_legend_grid_width”????[16]?“annotation_legend_grid_border”
[17]?“fast_hclust”
heatmap_legend_title_gp?=?gpar(fontsize?=?8,?fontface?=?“bold”),
heatmap_legend_labels_gp?=?gpar(fontsize?=?8),
heatmap_column_names_gp?=?gpar(fontsize?=?8),
heatmap_column_title_gp?=?gpar(fontsize?=?10),
heatmap_row_title_gp?=?gpar(fontsize?=?8)
)
#利用HeatmapAnnotation()對行或列注釋。HeatmapAnnotation()函數會(huì )生成一個(gè)注釋用的list對象。該函數的主要格式是HeatmapAnnotation(df/數據框, name/注釋名稱(chēng), col/注釋顏色列表, show_legend/是否顯示數據框中每一列的圖例)
#樣本類(lèi)型注釋?zhuān)琓umor樣本為pink，Control樣本為royalbule，名稱(chēng)在左邊
>ha?=?HeatmapAnnotation(type?=?type,
col?=?list(type?=?c(“Tumor”?=?“pink”,?“Control”?=?“royalblue”)),
annotation_name_side?=?“left”)
#不顯示圖例名稱(chēng)
>ha2?=?HeatmapAnnotation(type?=?type,
col?=?list(type?=?c(“Tumor”?=?“pink”,?“Control”?=?“royalblue”)),
show_legend?=?FALSE)
>ht_list?=?Heatmap(mat_meth,?name?=?“methylation”,?col?=?meth_col_fun,
column_order=?column_order,
top_annotation?=?ha,?column_title?=?“Methylation”)?+
#方向部分
Heatmap(direction,?name?=?“direction”,?col?=?direction_col)?+
#表達部分
Heatmap(mat_expr[,?column_tree$order],?name?=?“expression”,
col?=?expr_col_fun,
column_order?=?column_order,
top_annotation?=?ha2,?column_title?=?“Expression”)?+
#p值部分
Heatmap(cor_pvalue,?name?=?“-log10(cor_p)”,?col?=?pvalue_col_fun)+
#基因類(lèi)型部分
Heatmap(gene_type,?name?=?“gene?type”,?col?=?gene_type_col)?+
#基因注釋部分
Heatmap(anno_gene,?name?=?“anno_gene”,?col?=?anno_gene_col)?+
#距離部分
Heatmap(dist,?name?=?“dist_tss”,?col?=?dist_col_fun)?+
#增強子部分
Heatmap(anno_enhancer,?name?=?“anno_enhancer”,?col?=?enhancer_col_fun,
cluster_columns?=?FALSE,?column_title?=?“Enhancer”)
#以上熱圖相加后得到的是
#可以看到，整個(gè)熱圖是單個(gè)熱圖從左到右依次相加，圖例是從上到下依次相加，除了第一個(gè)熱圖的行聚類(lèi)樹(shù)保留了之外，其他的都默認被去除掉，順序和第一個(gè)熱圖保持一致。
#熱圖相加的返回值是一個(gè)HeatmapList對象。直接允許ht_list對象會(huì )默認調用draw()方法。通過(guò)顯式地調用draw()方法，你可以進(jìn)行更多的控制，例如圖例和標題。
#可以通過(guò)??`draw,HeatmapList-method`來(lái)查看draw的幫助
#分兩個(gè)cluster進(jìn)行聚類(lèi)，按hyper和hypo進(jìn)行分裂，加上整張熱圖的名稱(chēng)，設置圖例位置等
>draw(ht_list,?km?=?2,?split?=?direction,
column_title?=?“Comprehensive?correspondence?between?methylation,
expression?and?other?genomic?features”,
column_title_gp?=?gpar(fontsize?=?12,?fontface?=?“bold”),
merge_legends?=?TRUE,?heatmap_legend_side?=?“bottom”)
#重置全局參數消除影響
>ht_global_opt(RESET?=?TRUE)
復雜的熱圖顯示高度甲基化的DMR富含基因間和基因內區域，很少與增強子重疊。相反，低甲基化的DMR富含轉錄起始位點(diǎn)（TSS）和增強子。
知識點(diǎn)總結
1.ComplexHeatmap可實(shí)現單個(gè)熱圖的相加以實(shí)現數據之間的聯(lián)合。
2.ht_global_opt()函數可實(shí)現整個(gè)熱圖的全局控制，但要注意使用結束后進(jìn)行重置。
3.draw()函數在返回值是HeatmapList對象可以實(shí)現更多的控制。
]]>
pheatmap的安裝非常簡(jiǎn)單，只需要在R軟件中執行一行安裝代碼即可
install.packages('pheatmap')
安裝完成后，我們來(lái)看如何使用pheatmap來(lái)繪制聚類(lèi)熱圖
# 加載軟件包
library('pheatmap')
# 生成繪圖用的數據
test = matrix(rnorm(200), 20, 10)
test[1:10, seq(1, 10, 2)] = test[1:10, seq(1, 10, 2)] + 3
test[11:20, seq(2, 10, 2)] = test[11:20, seq(2, 10, 2)] + 2
test[15:20, seq(2, 10, 2)] = test[15:20, seq(2, 10, 2)] + 4
colnames(test) = paste("Test", 1:10, sep = "")
rownames(test) = paste("Gene", 1:20, sep = "")
這段代碼實(shí)際上是利用隨機數生成了一個(gè)20 X 10的矩陣。
為了模擬不同樣品和基因之間的差異，我們將第一行到第10行中奇數列的數值全部加3，將第11行到第20行的偶數列數值全部加2，將15行到20行的偶數列全部加4。最后將列名命名為T(mén)est1 ～ Test10，將行名命名為Gene1～Gene 20，最終生成的數據格式如下圖
默認參數繪制圖形只需要執行以下代碼。
pheatmap(test)
生成的圖片如下圖：
當默認參數不能滿(mǎn)足我們的需求時(shí)，我們可以根據自己的需要在此基礎上修改這個(gè)圖形。常見(jiàn)的一些參數設置如下：
pheatmap(test,?scale?=?"row")
# scale = “row”的含義是繪圖時(shí)按行進(jìn)行均一化。進(jìn)行均一化可以降低個(gè)別特殊樣品與其它樣品間的差異，這會(huì )使得其它樣品間的差異在圖形中更加顯著(zhù)。一般我們在基于表達量進(jìn)行聚類(lèi)分析時(shí)，均是常用的參數。繪圖結果如下圖所示：
如果需要對配色方案進(jìn)行修改，可以修改color參數，
# colorRampPalette函數可以設置3種顏色(只能是3種)，它可以根據給定的向量生成漸變色，這三個(gè)參數分別指定了最大值，中間值和最小值的顏色。繪圖結果如下：pheatmap(test,?color?=?colorRampPalette(c("navy",?"white",?"firebrick3"))(50))
同時(shí)，通過(guò)設置cluster_col和cluster_row參數可以控制是否取消對行或列進(jìn)行聚類(lèi)分析，具體代碼及結果如下：
pheatmap(test,?cluster_col?=?FALSE)
show_rownames和show_colnames參數來(lái)控制是否顯示行名和列名，如下：
pheatmap(test,show_rownames=F,show_colnames=F)
display_numbers 和number_color 參數可以控制是否在圖中顯示數字及設置數字的顏色。
pheatmap(test,?display_numbers?=?TRUE,number_color?=?"blue")
cellwidth和cellheight兩個(gè)參數可以控制每個(gè)單元的長(cháng)度和寬度。參數main可以在圖片中添加標題。
pheatmap(test,?cellwidth?=?15,?cellheight?=?12,?main?=?"Example?heatmap")
以上呢，就是在使用pheatmap繪制聚類(lèi)熱圖時(shí)常用的一些參數?？梢钥吹?，使用pheatmap繪制聚類(lèi)熱圖是非常簡(jiǎn)單快速的。通過(guò)組合不同的參數，我們可以控制最終生成的圖片的樣式與效果。更多的功能和參數可以通過(guò)執行pheatmap命令查看pheatmap自帶的幫助文檔來(lái)獵??！本期聚類(lèi)熱圖的繪制我們就分享完啦，敬請關(guān)注其他圖形繪制。
截止目前，百邁客成功舉辦了三場(chǎng)零基礎R語(yǔ)言繪圖培訓班.而由于我們培訓班主要是小班教學(xué)（20人左右），以及老師行程問(wèn)題，還有部分老師未趕上前三期培訓，因此，現特征集R語(yǔ)言培訓班東北、福建、西安、甘肅、北京場(chǎng)意向學(xué)員。如果您想學(xué)編程，想自己可以隨時(shí)繪制出編輯部要求的圖片，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們會(huì )根據大家填寫(xiě)的意向情況，安排后期的生信培訓班場(chǎng)次，說(shuō)不定下一場(chǎng)就在你的城市哦。
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