該文研究了SntI對基本細胞過(guò)程的影響，闡明了其與脂質(zhì)的分子相互作用，評估了其對衰老癌細胞的選擇性，并評估了增強生成的變異體在對抗癌癥和化療誘導的衰老方面的體內療效。此外，該研究為一類(lèi)天然衍生化合物能夠靶向衰老細胞這一概念提供了理論依據，這有可能開(kāi)創(chuàng )一種全新的衰老細胞清除劑的類(lèi)別。百邁客生物為該研究提供了轉錄組測序服務(wù)。

研究背景

細胞衰老是衰老的驅動(dòng)因素，也是腫瘤進(jìn)展的屏障，但衰老細胞的持續積累會(huì )引發(fā)炎癥和腫瘤復發(fā)?；熾m能抑制腫瘤，卻會(huì )誘導腫瘤微環(huán)境中出現衰老細胞，進(jìn)而導致治療相關(guān)不良反應并可能支持腫瘤復發(fā)?，F有衰老溶解藥物（senolytics）存在治療窗口窄、脫靶毒性、效價(jià)低或生物利用度有限等問(wèn)題，亟需開(kāi)發(fā)更有效的衰老治療方法和化合物。

毒液和毒素是新型治療劑的寶貴來(lái)源，其具有極高的特異性和效價(jià)，部分毒液中的肽已被證實(shí)可抑制腫瘤細胞生長(cháng)和擴散。

研究結果

• 探究來(lái)自加勒比海?？疽旱某煽锥舅豐ticholysin?I（StnI）的衰老溶解特性。
• 闡明StnI與脂質(zhì)的分子相互作用及其對衰老癌細胞的選擇性機制。
• 評估StnI優(yōu)化變體（StnIG）在體內針對癌癥和化療誘導衰老的療效。
• 提出?“senotoxins”（衰老毒素）這一新型天然來(lái)源化合物類(lèi)別，為衰老相關(guān)疾病治療提供新思路。

? StnI的體外衰老溶解特性細胞衰老誘導與表型驗證

通過(guò)palbociclib抑制CDK4/6，或使用多柔比星、博來(lái)霉素處理，成功誘導人黑色素瘤SKMel-147細胞、肝癌Huh7細胞、肺腺癌A549細胞、神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。衰老細胞表現為p53磷酸化水平降低、p21????表達升高、SA-β-半乳糖苷酶活性增強，且形態(tài)增大變扁平。

濃度與時(shí)間依賴(lài)性：StnI（0.1?nM-3?μM）對衰老SKMel-147細胞的viability具有濃度依賴(lài)性抑制作用，增殖細胞的IC??約為240nM，而palbociclib處理的衰老細胞IC??約為30?nM，衰老溶解指數為8。低濃度StnI（10-30?nM）的作用具有時(shí)間依賴(lài)性，延長(cháng)暴露時(shí)間可增強衰老溶解效果。

效價(jià)優(yōu)勢：StnI的衰老溶解功效與navitoclax相當，但效價(jià)是其13倍，且在多種化療誘導的衰老模型中均保持強效活性。同時(shí)，StnI處理不會(huì )改變衰老細胞的p16????、p21????表達及p53磷酸化水平，僅選擇性殺傷衰老細胞。

? StnI的結構改造與優(yōu)化（StnIG的構建）

結構域功能驗證：對StnI的N端兩親α-螺旋（aa1-29）、β-折疊區（aa58-101）、芳香簇（112-116）等結構域進(jìn)行截短改造，所有截短體均喪失衰老溶解活性，且對增殖細胞和衰老細胞的細胞毒性極低。蛋白質(zhì)變性（95℃處理45分鐘）后，StnI的衰老溶解活性完全消失，表明其全長(cháng)序列和構象對活性至關(guān)重要。

同源變體對比：StnI與同源變體StnII（序列同源性93%）相比，StnII對衰老細胞的細胞毒性低47倍（IC??≈1.4?μM?vs?30?nM），選擇性指數僅為0.92，遠低于?S8。差異源于N端電荷特性，StnI?N端含酸性殘基（E2、D9、E16）帶負電，而?StnII?N端為中性氨基酸。

StnIG的構建與優(yōu)勢：通過(guò)在N端引入甲硫氨酸（分泌時(shí)切除）、C端添加6xHis標簽，構建優(yōu)化變體StnIG。StnIG對增殖細胞的IC??約為1?μM，對衰老細胞的IC??仍為30nM，衰老溶解指數提升至31.25，高于StnI（8）和navitoclax（22.4）。StnIG處理24小時(shí)后，衰老細胞的損傷不可逆，而增殖細胞可逐漸恢復。

? StnI對細胞代謝與離子穩態(tài)的影響

轉錄組變化：對palbociclib誘導的衰老細胞進(jìn)行StnI（100?nM）處理，RNA測序顯示，6-12小時(shí)后細胞代謝通路（戊糖磷酸途徑、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)等）顯著(zhù)失調，腫瘤相關(guān)信號通路（TGF-β、JAK-STAT、MAPK等）下調。同時(shí)，鞘脂生物合成通路及離子轉運、鈣穩態(tài)相關(guān)基因（41個(gè)膜電位相關(guān)基因、40?個(gè)鈣信號相關(guān)基因）早期即出現表達異常。

線(xiàn)粒體功能損傷：StnI和StnIG處理后，衰老細胞的線(xiàn)粒體呼吸在15分鐘內短暫升高，隨后持續下降（StnI組降低33.5%±7%，StnIG組降低31.1%±2%），而變性StnIG無(wú)此效果。增殖細胞經(jīng)StnIG處理后，基礎呼吸僅降低15.1%±2%，遠低于衰老細胞。衰老細胞的線(xiàn)粒體膜電位去極化，ATP偶聯(lián)效率、最大呼吸能力和備用呼吸容量均顯著(zhù)降低，且持續24小時(shí)以上，伴隨凋亡增加（Annexin?V陽(yáng)性細胞比例升高）。

離子平衡紊亂：膜片鉗分析顯示，衰老細胞的細胞膜去極化，鉀通道（主要為鈣激活鉀通道KCa）密度降低。StnIG處理后，衰老細胞出現持續的鉀外流、鈉內流和鈣內流，細胞膜超極化。其中，鈣內流主要來(lái)自細胞外，且可激活KCa通道（尤其是BKCa和IKCa亞型），進(jìn)一步促進(jìn)鉀外流，導致細胞體積減小。

? StnIG誘導衰老細胞死亡的機制

鈣依賴(lài)性細胞死亡：StnIG處理后，衰老細胞內鈣水平持續升高，下調BKCa通道調節亞基KCNMB4，增強BKCa通道活性。使用鈣螯合劑（EGTA、BAPTA）或?BKCa通道阻滯劑（charybdotoxin）可顯著(zhù)削弱StnIG的衰老溶解效果，表明鈣內流和BKCa激活是細胞死亡的關(guān)鍵環(huán)節。

凋亡與焦亡的協(xié)同作用：StnIG誘導的衰老細胞死亡不依賴(lài)壞死性凋亡，但對caspase-1/4抑制劑（VX-765）和泛caspase抑制劑（z-VAD?FMK）敏感。流式細胞術(shù)證實(shí)，StnIG可誘導衰老細胞發(fā)生早期凋亡（不依賴(lài)BKCa激活），而持續的鈣內流和BKCa激活促進(jìn)細胞體積減小和晚期凋亡，同時(shí)伴隨焦亡發(fā)生。BKCa激活劑BMS-191011可增強StnIG的細胞毒性。

? StnIG對衰老細胞的選擇性機制（脂質(zhì)結合特異性）

衰老細胞的脂質(zhì)組重塑：與增殖細胞相比，衰老SKMel-147細胞的脂質(zhì)譜發(fā)生顯著(zhù)變化，磷脂酰絲氨酸（PS）、鞘磷脂（SM）和線(xiàn)粒體心磷脂（CL）含量降低，磷脂酰膽堿（PC）、醚鍵磷脂酰乙醇胺（PE?O-）、膽固醇酯（CE）和甘油三酯（TAG）含量升高。同時(shí)，溶血磷脂（LPC、LPE-O、LPI、LPS）含量增加。

脂質(zhì)對StnIG毒性的調控：補充PC（100?μM?POPC）可增強增殖細胞對StnIG的敏感性；外源性鞘磷脂酶降解SM后，StnIG的細胞毒性增強；補充SM（100?μM）可減輕StnIG對衰老細胞的損傷，但會(huì )增加其對增殖細胞的毒性；脂蛋白耗竭血清（LPDS）處理后，StnIG對增殖細胞的毒性增強，對衰老細胞的毒性減弱。

分子結合機制：基于同源蛋白FraC的晶體結構建模顯示，StnIG的α2螺旋（膜結合區）含關(guān)鍵殘基Gln130、Tyr133、Glu134等，其中Glu134和Gln130可與?PE、PS脂質(zhì)的頭部基團形成穩定氫鍵（結合距離<3??），且結合持續時(shí)間顯著(zhù)長(cháng)于與其他脂質(zhì)的相互作用。健康細胞中PE、PS位于細胞膜內葉，而衰老細胞的膜不對稱(chēng)性破壞，PE、PS暴露于外葉，為StnIG提供特異性結合位點(diǎn)。

? StnI/StnIG的體內療效驗證

斑馬魚(yú)異種移植模型：將palbociclib誘導的衰老SKMel-147細胞注射到斑馬魚(yú)胚胎的Cuvier循環(huán)導管，10?nM?StnIG處理6天后，衰老細胞積累量顯著(zhù)降低，效果與1μM?navitoclax相當，且無(wú)明顯毒性。

小鼠異種移植模型：在SKMel-147黑色素瘤和Huh7肝癌小鼠異種移植模型中，palbociclib（100?mg/kg，口服）聯(lián)合StnIG（2?mg/kg，腹腔注射，每48小時(shí)一次）治療，腫瘤體積顯著(zhù)縮小，療效與palbociclib聯(lián)合navitoclax（50?mg/kg，口服）相當。腫瘤組織中SA-β-半乳糖苷酶活性降低，SASP相關(guān)基因（IL-6、BCL2、CASP1）表達顯著(zhù)下調。

安全性評估：StnIG處理的小鼠體重僅降低5%-10%（navitoclax組為?5%），對腦、心、肺、肝、腎等器官無(wú)明顯組織學(xué)損傷，肝腎功能指標正常。僅在衰老腫瘤組中觀(guān)察到血鉀水平升高，可能與腫瘤細胞裂解釋放鉀離子相關(guān)，可作為治療效果的生物標志物。

? StnIG在非轉化細胞中的作用

對化療誘導的新生兒包皮成纖維細胞和真皮成纖維細胞無(wú)衰老溶解效果，但對復制性衰老成纖維細胞具有顯著(zhù)的衰老溶解活性。

在人肺成纖維細胞IMR90中，StnIG具有衰老形態(tài)調節作用（senomorphic?effect），10.13?nM即可顯著(zhù)降低SA-β-半乳糖苷酶活性，且不誘導細胞死亡；134.6?nM時(shí)表現出衰老溶解活性，有效清除衰老細胞群體。

研究總結

該研究為StnIG在癌癥治療中的潛在作用提供了概念性證明，表明其與誘導腫瘤衰老的化療藥物聯(lián)合使用時(shí)療效顯著(zhù)提升。還證實(shí)了StnIG在人類(lèi)成纖維細胞中的衰老相關(guān)潛力，這引發(fā)了關(guān)于其在衰老及與衰老相關(guān)疾病中的作用的更多疑問(wèn)。然而，關(guān)于senotoxins對未轉化和有復制能力的衰老細胞的衰老消除作用背后的機制仍不清楚。未來(lái)的研究還應探究StnIG在其他與衰老相關(guān)的疾?。ㄈ绶卫w維化?、腎臟疾病或甚至改善早老癥綜合征的癥狀）中的療效。

 
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