英文標題：MADS-box transcription factors determine the duration of temporary winter dormancy in closely related evergreen and deciduous Iris spp.

發(fā)表雜志：JournalofExperimentalBotany

影響因子：7.86

發(fā)表單位：浙江大學(xué)

原文鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34752617

研究背景

冬季休眠是植物應對潛在致命環(huán)境的最關(guān)鍵策略。近幾十年來(lái)，由于氣候的變化，在經(jīng)濟上具有重要意義的多年生雙子葉植物中的這一過(guò)程得到了廣泛的研究。然而，在不需要冷卻的常綠單子葉植物中，休眠過(guò)程至今仍是一個(gè)謎。因此，揭示這些單子葉植物越冬休眠的調控機制，不僅有助于更好地開(kāi)發(fā)利用植物資源，而且對應對全球變暖帶來(lái)的低溫不足的挑戰具有重要意義。通過(guò)多年物候觀(guān)測發(fā)現，鳶尾和蝴蝶花越冬休眠過(guò)程均僅有生態(tài)休眠，將休眠植株移至適宜條件下能迅速恢復生長(cháng)，且在同一栽培地區二者越冬休眠期存在明顯差異，是研究多年生單子葉植物越冬休眠機理的理想材料。本研究比較了鳶尾(I.tectorum)和蝴蝶花(I.japonica)在關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的休眠過(guò)程。這兩種鳶尾都表現出短暫的休眠過(guò)程，且持續時(shí)間不同，在溫暖條件下都能很容易地恢復生長(cháng)。為了破譯轉錄變化，作者對鳶尾進(jìn)行了全長(cháng)測序，對蝴蝶花進(jìn)行了RNA-seq測序，分別生成參考轉錄組，揭示了調控常綠與落葉類(lèi)鳶尾越冬休眠的分子機制。

材料

兩種鳶尾屬植物1年生大小一致的根莖。每?jì)芍懿杉覙悠?包括根梢和3片幼嫩葉片)，立即用液氮冷凍，80℃保存待分析.

方法

鳶尾（IT）：從每個(gè)根尖莖樣品中提取的總RNA等混合構建一個(gè)文庫，利用PacBio平臺進(jìn)行測序。并將5個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段，即秋季生長(cháng)(FG)、休眠誘導(DI)、休眠(D)、休眠解除(DR)和春季生長(cháng)(SG)的樣本使用Illumina進(jìn)行RNA-seq測序，并設置三個(gè)生物重復。

蝴蝶花（IJ）：利用Illumina平臺對FG、DI、D、DR、SG階段的樣本進(jìn)行測序，并進(jìn)行從頭組裝，為蝴蝶花生成參考轉錄組。

結果

一、鳶尾的季節性生長(cháng)-休眠周期和休眠狀態(tài)的確定

作者首先追蹤了鳶尾的季節性生長(cháng)-休眠周期，發(fā)現其在休眠期間的形態(tài)變化不同于多年生雙子葉植物。通過(guò)一項大規模的野外實(shí)驗，將常綠鳶尾和落葉鳶尾植物暴露在不同的生長(cháng)-休眠狀態(tài)下。兩種鳶尾均表現出相似但不同的生長(cháng)-休眠動(dòng)態(tài)。后續對采集的樣品進(jìn)行再生長(cháng)試驗以驗證其休眠狀態(tài)，兩種鳶尾均經(jīng)歷了短暫的休眠。值得注意的是，在同一階段，IJ相對于IT感知到更低水平的休眠誘導刺激。

二、轉錄組數據差異分析及功能鑒定

IT參考轉錄組由短讀RNA-Seq獲得，由83,351個(gè)轉錄本組成。IJ的FL參考轉錄組由58,654個(gè)平均長(cháng)度為2,411bp的非冗余轉錄本組成。PCC對每個(gè)物種的所有轉錄本進(jìn)行分析，驗證了在每個(gè)階段收集的生物重復的一致性，不同日期的樣本處于不同的生長(cháng)-休眠階段。在IJ和IT分別鑒定出15118個(gè)和10176個(gè)差異轉錄本。為了確定不同生長(cháng)-休眠階段之間的轉錄變化，作者比較了每個(gè)鳶尾物種在相鄰階段的轉錄本表達，在IJ中生長(cháng)-休眠轉變比休眠-生長(cháng)轉變引起更復雜的轉錄變化，而在IT中正好相反。這些表達差異與物種間的形態(tài)差異一致。轉錄因子預測顯示LOB、MADSMIKC和NF-YC轉錄因子家族在IJ中差異比率最高。為了更深入地了解物種間差異轉錄本的功能差異，我們對每個(gè)比較中上調或下調的差異轉錄本進(jìn)行KEGG富集分析。各鳶尾物種在D期前后，代謝途徑相對豐富，尤其是碳水化合物相關(guān)的代謝途徑，并且對差異表達變化明顯的基因進(jìn)行PCR驗證。

三、共表達網(wǎng)絡(luò )揭示了越冬性休眠特有的基因模塊

為了了解基因和通路的動(dòng)態(tài)變化，并識別鳶尾越冬性休眠過(guò)程中的休眠相關(guān)模塊，我們對IJ的所有15118個(gè)差異轉錄本進(jìn)行了WGCNA分析，共鑒定出12個(gè)共表達模塊.對每個(gè)模塊進(jìn)行了主要的表達趨勢和KEGG富集分析。并進(jìn)行模塊-形狀關(guān)聯(lián)分析，選擇形狀特異性模塊和階段特異性模塊。結果中找到分別與冬季生長(cháng)率呈顯著(zhù)正、負相關(guān)的生長(cháng)模塊（red）和休眠模塊（brown），MADS-box家族基因FUL/AP1和SVP分別位于兩個(gè)模塊，并與植物激素合成與信號轉導、碳水化合物代謝和環(huán)境響應通路基因共表達。

四、差異轉錄本的表達及與植物激素相關(guān)的生理特性

為了進(jìn)一步解剖鳶尾越冬休眠所必需的基因和通路，我們對基因表達譜和相關(guān)生理特征進(jìn)行了更詳細的研究。結果表明，脫落酸水平在D期升高了兩倍以上，并與SER呈顯著(zhù)負相關(guān)，表明脫落酸在鳶尾越冬休眠中的保守作用。脫落酸生物合成和分解代謝的穩態(tài)jing q調控植物中的脫落酸水平。相比之下，IJ中參與脫落酸生物合成的差異轉錄本在DI過(guò)程中保持較低的表達水平。因此，作者推斷IJ中脫落酸水平的降低比IT中保證了更長(cháng)的營(yíng)養生長(cháng)周期。推測這可能是由于脫落酸生物合成的抑制和分解代謝的活躍所致。

與脫落酸不同的是，在之前的休眠研究中很少關(guān)注茉莉酸。然而，茉莉酸與脫落酸協(xié)同相互作用，阻止植物生長(cháng)，并調節防御過(guò)程。相比之下，兩種虹膜物種的茉莉酸水平與SER呈正相關(guān)，并與生長(cháng)相關(guān)的MERed呈顯著(zhù)正相關(guān)，表明茉莉酸可能促進(jìn)鳶尾越冬性休眠期間的生長(cháng)。因此，茉莉酸生物合成基因LOX的強烈上調可能有助于兩種鳶尾在DR階段茉莉酸的快速積累。此外，在兩個(gè)物種中茉莉酸/脫落酸和SER均呈正相關(guān)，表明茉莉酸和脫落酸可能在鳶尾越冬性休眠過(guò)程中起拮抗作用。在本研究中，編碼茉莉酸的差異轉錄本在兩種鳶尾中均表現出不同的表達模式，這可能導致了不同的休眠時(shí)間。它們不同的串擾模式可能與虹膜越冬性休眠的形成有關(guān)，因為脫落酸和茉莉酸可以協(xié)調作用常綠和落葉鳶尾的營(yíng)養生長(cháng)和應激反饋。

五、差異轉錄本在碳水化合物代謝和蔗糖和淀粉含量中的表達

蔗糖是從光合源器官(如葉片)到貯藏組織的初級糖。當植物處于旺盛狀態(tài)時(shí)，蔗糖轉化為淀粉的轉化率很高。相反，淀粉降解途徑主要通過(guò)積累可溶性糖來(lái)降低細胞滲透壓，同時(shí)釋放內休眠和構建生態(tài)休眠。因此，處于生態(tài)休眠狀態(tài)的植物在休眠器官中積累了較高的糖含量，并且在休眠植物中糖含量更高。與此相一致，IJ中蔗糖含量較低可能導致休眠持續時(shí)間相對于IT較短。此外，正如之前所觀(guān)察到的，IJ中較低的淀粉積累在一定程度上證實(shí)了其較低的生態(tài)休眠特征。此外，蔗糖含量可能作為信號分子影響脫落酸敏感性，從而抑制生長(cháng)。與此相一致的是，脫落酸相關(guān)基因與IJ淀粉合成模塊中的基因共表達。綜上所述，IJ中活性淀粉的生物合成和活性淀粉的降解程度較高，導致蔗糖含量較低的時(shí)間較長(cháng)，這可能與休眠時(shí)間比IT短有關(guān)。

六、差異轉錄本與ROS清除中的生理生化變化

ROS積累被認為是觸發(fā)生態(tài)氣味的重要信號機制，并與休眠時(shí)間呈負相關(guān)。與此同時(shí)，激活抗氧化防御和解毒途徑以去除ROS。在本研究中，差異轉錄本從DI到DR，與IJ相比，IT脯氨酸積累更多，SOD活性更高，表明IT中ROS清除能力更強。同樣，編碼GST的差異轉錄本上調的時(shí)間更早，這可能導致休眠進(jìn)入IT的時(shí)間較早。綜上所述，這些指標的變化使IT比IJ表現出更強的氧化應激反應。因此，相對于IT，IJ中脯氨酸濃度較低，SOD活性較低，GST基因表達隨后升高，表明IJ中休眠時(shí)感知的ROS應激水平較低，這可能導致其休眠時(shí)間較短。

七、休眠過(guò)程中MIKCCMADS-box基因的系統發(fā)育分析及表達模式

MIKCCMADS-box基因編碼在植物生長(cháng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉錄因子，這些轉錄因子在真核生物中高度保守。為了研究鳶尾MIKCCMADS-box蛋白之間的系統發(fā)育關(guān)系，并對其亞家族進(jìn)行分類(lèi)，以具有代表性的植物為樣本構建了系統發(fā)育樹(shù)，揭示了其在單、雙子葉植物中的保守性，以及FLC和FUL/AP1等在多年生單子葉植物短暫越冬休眠過(guò)程中的新功能。

總結

本研究通過(guò)全長(cháng)轉錄組分析，得到MADS-box家族基因可能在調控鳶尾越冬休眠過(guò)程中發(fā)揮重要功能，并通過(guò)WGCNA共表達分析找到與冬季生長(cháng)率相關(guān)的基因模塊，并對上述通路的基因表達和生理生化變化進(jìn)行分析，發(fā)現脫落酸和茉莉酸在協(xié)調兩種鳶尾越冬生長(cháng)和脅迫響應中發(fā)揮拮抗作用，而碳水化合物代謝和活性氧清除能力的差異可能導致了常綠與落葉鳶尾越冬休眠期長(cháng)短不同。另外，對兩種鳶尾和代表性植物MIKCCMADS-box成員進(jìn)行進(jìn)化分析，揭示了單子葉在臨時(shí)WD過(guò)程中的一些共同特征，以及單子葉中可能存在的新角色，如開(kāi)花位點(diǎn)C和FUL。綜合來(lái)看，本項研究結果不僅提供了多年生單子葉植物中越冬休眠的圖像，而且也為植物中越冬休眠的調控機制提供了新的見(jiàn)解。

研究背景

甘薯是許多發(fā)展中國家重要的作物之一，也是重要的能量來(lái)源。甘薯是同源六倍體植物，基因組大小約3-4G，目前還沒(méi)有高質(zhì)量的參考基因組。甘薯采用異花授粉的繁殖方式，自交不孕，導致基因組的雜合度高，目前還沒(méi)有關(guān)于甘薯正向遺傳學(xué)研究的報道。幾乎所有關(guān)于甘薯轉錄本的研究都是采用轉錄組測序的方法，沒(méi)有獲得大規模的全長(cháng)cDNA序列，因此阻礙了甘薯功能基因組學(xué)和分子育種研究的進(jìn)展。長(cháng)期以來(lái)，人們一直認為甘薯有可能由二倍體祖先野生甘薯（I. trifida）進(jìn)化而來(lái)，但是沒(méi)有確鑿的證據。

研究目的

通過(guò)2+3聯(lián)合測序的方法獲得甘薯和野生甘薯的全長(cháng)轉錄本，揭示二者的進(jìn)化關(guān)系。

材料方法

實(shí)驗材料
甘薯和野生甘薯，不同組織（幼葉、成熟葉、莖尖、莖稈、須根、起始塊根、膨大塊根和成熟塊根）分別等重量混合，提取RNA用于三代測序；同樣的材料用于二代測序。
測序方法及數據量
百邁客Pacbio RSII：構建1-2k、2-3k、>3k的3個(gè)文庫，每個(gè)文庫分別測1個(gè)、2個(gè)、1個(gè)cell，共8個(gè)cell。
百邁客Illumina HiSeq 2500：甘薯和野生甘薯各測了17G和11G數據。

技術(shù)路線(xiàn)

研究結果

5.1 全長(cháng)轉錄本的統計及結構注釋分析
統計三代的數據發(fā)現：甘薯得到220,035 個(gè)ROI（reads of insert），其中全長(cháng)非嵌合轉錄本（Full-Length Non-Chimeric, FLNC）占49.9％，非全長(cháng)轉錄本（Non-Full-Length, NFL）占46.6％；野生甘薯得到195,188 個(gè)ROI，其中FLNC 和NFL 分別占52.1％和43.9％。對三代的數據進(jìn)行矯正（自我糾錯+二代數據矯正），甘薯和野生甘薯分別獲得了53,861和51,184個(gè)非冗余轉錄本。此外，甘薯和野生甘薯分別預測到了104,540 和94,174 個(gè)ORF，全長(cháng)轉錄本（同時(shí)含有5’-UTR，CDS和3’-UTR）分別有34,963和33,637個(gè)。甘薯和野生甘薯分別鑒定到了 25,315和 27,090 個(gè)SSR，以及471 和531 個(gè)lncRNA。

Figure 1. 對三代測序的數據進(jìn)行分類(lèi)統計和結構注釋

5.2 甘薯、野生甘薯與其它植物的CDS比較分析
為了評估甘薯、野生甘薯的轉錄本和其他植物基因的相似性，我們比較了甘薯、野生甘薯與其他植物的開(kāi)源CDS數據庫，包括紅苔藤、野生甘薯、牽?；?、煙草、馬鈴薯、大豆、擬南芥和水稻。結果表明甘薯和野生甘薯大多數的轉錄本都是同源的，說(shuō)明這兩個(gè)物種擁有一個(gè)大致相同的基因庫。觀(guān)察高比例的轉錄本發(fā)現，盡管這些物種中的大量基因在進(jìn)化過(guò)程中存在著(zhù)巨大的差異，但仍然共有一些短的motif，說(shuō)明這些基因在進(jìn)化上顯示出高度的保守性。

Figure 2. 比較甘薯、野生甘薯和其他植物的轉錄本

5.3 全長(cháng)轉錄本的結構分析
三代測序得到的全長(cháng)cDNA對于研究基因的結構非常有用，例如分析外顯子-內含子的結構。我們隨機挑選了50個(gè)基因進(jìn)行比較，發(fā)現這些基因含有的外顯子數目在甘薯、野生甘薯和擬南芥三個(gè)植物中的分布是相似的。

Figure 3. 分析甘薯、野生甘薯和擬南芥的外顯子-內含子結構

5.4 甘薯和野生型甘薯的Ka/Ks分析
人們普遍認為二倍體野生甘薯是六倍體作物甘薯的祖先，為了尋找參與甘薯進(jìn)化的候選基因，我們研究了甘薯和野生甘薯的基因選擇模式。首先比較了二者的完整轉錄本數據集，去除有多種同源性可能的那些轉錄本，確定了1269個(gè)假定的甘薯和野生甘薯之間的同源基因對。隨后，計算了每個(gè)基因對的Ka/Ks比值，大多數基因對的Ka/Ks比值都小于1，只有56個(gè)基因對的Ka/Ks比值大于1，表明在甘薯的進(jìn)化或馴化過(guò)程中，大多數基因都是受到純化選擇的。而受到正向選擇的這些基因將作為后續研究的重點(diǎn)。

Figure 4. 分析甘薯和野生甘薯同源基因對的Ka/Ks比值

創(chuàng )新點(diǎn)

1，對于無(wú)參或者參考基因組不好的物種，全長(cháng)轉錄組可以獲得轉錄本全長(cháng)序列，完善基因組注釋的信息。
2，通過(guò)全長(cháng)比較轉錄組分析研究近源物種間的進(jìn)化關(guān)系。

參考文獻：
Generation and comparative analysis of full-length transcriptomes in sweetpotato and its putative wild ancestor I. trifida（bioRxiv在線(xiàn)發(fā)表，2017）